尽管节肢动物类(主要指昆虫纲和蛛形纲)病媒和害虫的综合治理取得了较大进展,但其对公共卫生及人类健康仍造成巨大威胁,且这种情形随着全球化、城市化和常规杀虫剂滥用以及抗药性的发展变得更加严峻.有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类常规杀虫剂在历史上对保护人类和动物免于病媒生物和其他城市害虫的侵害起着重要作用,但这些杀虫剂对环境和非靶标生物的不良影响在全球范围内也越来越受到关注.20世纪70年代以来,随着对节肢动物生物学的深入了解,基于昆虫生长调节剂的软性杀虫剂的研发受到了极大的重视.传统杀虫剂因具有易获得和见效快等优点已被使用者和公众广泛接受,软性杀虫剂的研发经历曲折.然而,基于昆虫激素类似物、模拟物或者激动剂以及几丁质合成抑制剂的软性杀虫剂在很多方面也取得了长足的进展.软性杀虫剂中发展和使用最成功的案例是保幼激素类似物(比如烯虫酯、烯虫乙酯和烯虫炔酯),已经应用于多种病媒生物和环境害虫的治理.最近,S-烯虫酸叔丁酯的诞生又带来了新的成功机遇.保幼激素模拟物吡丙醚和苯氧威因在病媒生物和其他害虫治理中具有显著的应用价值也得到了较好的研究和开发.保幼肽因其生物活性和作为多肽可以预期的环境安全性,近年来再次引起人们的关注.相比保幼激素类似物,蜕皮激素受体激动剂对靶标生物具有更宽的敏感窗口期,研发潜力巨大.几丁质合成抑制剂因其作用方式独特和杀虫谱广而备受重视.总之,不管软性杀虫剂单独使用,还是与传统杀虫剂联合使用,在不久的未来都将在病媒生物及其他城市害虫的治理方面发挥重要作用.

[目的]本研究旨在鉴定褐飞虱Nilaparvata lugens G蛋白β亚基基因(NlGβ)并分析其功能,以期为基于RNAi技术防治褐飞虱提供潜在的新靶标基因.[方法]利用PCR克隆并验证褐飞虱NlGβ的编码序列(coding sequence,CDS)并进行生物信息学分析;基于褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和成虫不同组织(头、足、肠道、表皮、脂肪体、雌性生殖系统和雄性生殖系统)转录组表达谱分析NlGβ的时空表达模式;通过对2和5龄褐飞虱若虫进行显微注射dsRNA沉默NlGβ,观测个体和雌性生殖系统表型,统计存活率、单雌产卵量和卵孵化率,利用透射电子显微镜技术观察侧输卵管膨大区.[结果]褐飞虱NlGβ(GenBank登录号:XP_022200908.1)的CDS长948 bp,NlGβ蛋白包含7个WD40结构域和4个WD_REPEATS_1基序,是一个较为保守的蛋白,除了直翅目昆虫外,来源于其他昆虫目中的NlGβ同源蛋白能很好地聚集在同一簇进化分支上.NlGβ的表达量在1-3龄若虫期呈现周期性变化,在5龄雌若虫和雌成虫中的表达量高于5龄雄若虫和雄成虫中的;NlGβ在成虫不同组织中都表达,但在脂肪体中表达量最高,在雌性生殖系统中的表达量高于雄性生殖系统中的.沉默褐飞虱2龄若虫NlGβ,出现蜕皮困难的现象,导致存活率较dsGFP对照组显著降低;沉默褐飞虱5龄若虫NlGβ,雌成虫腹部异常膨大,卵巢发育畸形,单雌产卵量较对照组显著下降,卵无法孵化,侧输卵管膨大区内分泌物增加,上皮细胞发生降解.[结论]NlGβ与褐飞虱的生长发育和雌虫的繁殖密切相关.

为明确朝天椒(品种:BLTY2)叶片饲喂的斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫生长发育受到抑制的关键原因,本研究以人工饲料及牛角椒(品种:FXBX)叶片饲喂的斜纹夜蛾幼虫为对照,通过比较3种食料饲喂后斜纹夜蛾幼虫相关生理生化指标的变化,分析BLTY2辣椒叶片饲喂所致的斜纹夜蛾幼虫生长发育异常的原因.结果表明,朝天椒辣椒叶片饲喂的斜纹夜蛾幼虫生长发育速率滞后于牛角椒辣椒叶片及人工饲料饲喂的斜纹夜蛾幼虫,且每头幼虫的发育时长均显著延长(P＜0.05).饲喂后第1天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天,饲喂BLTY2辣椒叶片的斜纹夜蛾幼虫体内保幼激素(JH)含量均显著高于其他2种食料饲喂的斜纹夜蛾幼虫(P＜0.05).饲喂后第3天、第4天、第5天和第7天,饲喂BLTY 2辣椒叶片的斜纹夜蛾幼虫体内蜕皮激素(Ecd)含量均显著高于其他2种食料饲喂的斜纹夜蛾幼虫(P＜0.05).3种食料饲喂后斜纹夜蛾幼虫体内的几丁质酶(CHT)活性变化差异较大,而2种辣椒叶片饲喂后斜纹夜蛾幼虫体内的组织蛋白酶(CTS)活性变化趋势相似,且不同于人工饲料饲喂的斜纹夜蛾幼虫体内的CTS活性变化趋势.由此可见,BLTY2辣椒主要干扰斜纹夜蛾幼虫体内JH与Ecd的含量抑制其生长发育.本研究结果可为筛选具有抗虫活性的植物次生代谢物质奠定基础.

几丁质酶是降解几丁质的糖苷水解酶,参与昆虫蜕皮、器官发育、免疫等重要生理过程.目前,寄生蜂等膜翅目昆虫中几丁质酶的鉴定以及功能研究仍较少.本研究基于生物信息学分析,在丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis基因组中鉴定到14个几丁质酶基因,氨基酸个数介于312～2 682之间.系统进化分析表明丽蝇蛹集金小蜂几丁质酶分为9个亚家族,其中Group Ⅳ、Ⅶ亚家族可能通过基因串联复制而发生基因家族扩增.qRT-PCR分析结果表明几丁质酶基因的表达具有多样性,其中NvCht1、NvCht5、NvCht6、NvCht7 4个基因在1.5 d幼虫表达量最高,NvCht3在5 d幼虫表达量最高,NvCht8在幼虫期高表达.此外,幼虫组织中的表达分析结果表明NvCht4、NvCht5、NvCht10、NvCht12 在表皮中高表达,NvCht7、NvCht8、NvCht13 在肠道中高表达,NvCht9 在脂肪体和表皮中高表达,NvCht11在唾液腺中高表达.本研究为寄生蜂几丁质酶的进化分析以及功能研究提供理论基础.

蜕皮是许多变态发育昆虫的一种重要生理现象,昆虫通过蜕皮液中的酶对新旧表皮进行分离.已有相关蛋白组学的研究证明,家蚕蜕皮液中具有一种含量丰富的羧肽酶 A(Bombyx mori-carboxypeptidase A,Bm-CPA),目前对其作用功能尚不清楚.为了更好地了解Bm-CPA在家蚕蜕皮发育过程的作用,本研究通过生物信息学分析、实时荧光定量 PCR、抗体制备、免疫荧光染色和毕赤酵母表达等方法对Bm-CPA进行了研究.结果显示,Bm-CPA具有保守的M14 锌羧肽酶结构域和糖基化位点,并且受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)调控,在眠期和上簇期的表皮中大量表达;免疫荧光染色显示 Bm-CPA 在眠期的表皮中富集,Bm-CPA 抑制剂会导致幼虫因无法蜕皮而死亡;通过毕赤酵母表达系统在体外成功获得大量的重组 Bm-CPA 蛋白.这些结果为深入了解家蚕蜕皮发育过程提供了一定的参考.

昆虫卵黄原蛋白(Vitellogenins,Vg)是一种多功能的生殖发育关键调控蛋白,在不同昆虫体内的结构、合成调控及功能不尽相同.随着基因编辑技术的成熟,运用分子手段调控Vg的合成,可减少卵黄发生,降低昆虫的繁殖力,成为有效防治害虫的优势方法之一.因此,Vg及其合成调控的研究受到广泛关注.半翅目害虫是农林业的重点防治对象之一,除直接刺吸为害寄主外,其常传播植物病原体,对农业生产造成了严重危害.半翅目昆虫Vg除在生殖发育中的关键作用外,还与病原菌的传播、寄主免疫等密切相关,可成为分子水平防治半翅目害虫及其继发病害的优势靶标.因此,本文总结了半翅目昆虫Vg的合成方式、合成场所,指明了其结构上蛋白亚基数目的差异,概述了其与昆虫免疫反应、植物防御、病毒传播等有关的研究进展,总结了其合成的保幼激素(包括保幼激素受体Methoprene-tolerant和转录因子Krüppel homolog 1等关键调控因子等)、蜕皮激素和胰岛素信号通路等主要的内分泌激素调控通路,以及以营养信号调控为主的非激素调控通路,为探索半翅目害虫的分子防控手段提供理论依据.

[目的]本研究旨在解析ATP合酶亚基α(ATP synthase subunit α,ATPs-α)在棉铃虫Helicoverpa armigera变态和发育中的功能机理.[方法]PCR扩增棉铃虫ATPs-α基因开放阅读框,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR检测HaATPs-α在棉铃虫5龄蜕皮期和6龄第1-5天幼虫表皮、中肠和脂肪体中及外源20-羟蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)(0.1 mg/mL)处理后6龄幼虫表皮和脂肪体中的表达量;对棉铃虫6龄幼虫注射dsHaATPs-α,分析RNAi降低HaATPs-α的表达量对幼虫发育及变态及其体内ATP含量、海藻糖和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性的影响.[结果]棉铃虫HaATPs-α的开放阅读框长1 677 bp,棉铃虫、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda、斜纹夜蛾S.litura和粉纹夜蛾Trichoplusiani这4种鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)昆虫的ATPs-α氨基酸序列一致性为96.56％,且亲缘关系较近.表达模式分析结果显示,HaATPs-α在6龄第3天幼虫表皮和中肠中表达量最高,在5龄蜕皮期脂肪体中出现表达高峰;20E(0.1 mg/mL)处理较对照显著上调6龄幼虫中HaATPs-α的表达量.与对照组(注射dsGFP)相比,利用RNNAi敲低HaATPs-α表达量后,幼虫发育迟缓,幼虫体重显著下降,幼虫死亡率显著升高,化蛹率和成虫羽化率显著降低,ATP含量和海藻糖酶活性均显著降低,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量显著降低.[结论]HaATPs-α不仅控制棉铃虫ATP的产量,同时还影响着海藻糖和葡萄糖的含量,因此,HaATPs-α在幼虫变态中发挥着重要作用.本研究结果还可为将来利用ATPs-α作为有害生物防控的新靶标提供实验证据和理论依据.

[目的]雌激素雌二醇(E2)在脊椎动物中通过雌激素受体(ER)调节脊椎动物的生长发育和繁殖.昆虫中并没有ER,但有研究显示某些昆虫能对E2产生一定的应答.本研究在明确E2能影响家蚕Bombyx mori卵黄原蛋白基因(BmVg)表达的前提下,分析其对这一基因表达的调控机制.[方法]取BmVg高量表达时的家蚕雌性幼虫(上蔟后60 h)脂肪体,用不同浓度(0.001,0.05,0.5,5和50 nmol/L) E2处理后,通过qRT-PCR检测BmVg表达的变化,分析家蚕对E2的应答;克隆家蚕蜕皮激素受体基因(BmEcRB1),构建原核表达载体,表达并纯化BmEcRB1蛋白后与E2体外孵育,通过微量热泳动仪(MST)分析E2与BmEcRB1的结合情况.[结果]不同浓度E2均显著抑制离体培养的雌蚕脂肪体中BmVg基因的表达.MST实验证实,E2与BmEcRB1具有一定的亲和力,解离常数(Kd)为77.8±22 μmol/L.[结论]结果说明,E2对BmVg表达的影响是通过与蜕皮激素(20E)竞争性结合BmEcRB1实现的.

昆虫几丁质酶参与昆虫蜕皮、消化、防御及免疫等多种生理过程,在昆虫的变态和发育中发挥着重要作用.本研究采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆获得小菜蛾Plutella xylosteUa几丁质酶基因,命名为PxyChi.该基因开放阅读框长1677 bp,编码558个氨基酸,推测的蛋白分子量为62.03 kDa.氨基酸序列分析表明,小菜蛾几丁质酶第1-19位氨基酸为蛋白的信号肽,且该序列具有典型昆虫几丁质酶的4个保守氨基酸序列.蛋白结构域分析表明,PxyChi属于几丁质酶Group Ⅱ家族.进化树分析表明:PxyChi与同属鳞翅目二化螟Chilo suppressalis的几丁质酶亲缘关系最近,为75.5％.不同发育时期的荧光定量PCR分析表明,PxyChi在小菜蛾各个发育时期的表达量不同,其中PxyChi在2、3、4龄幼虫、蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的28.22、0.76、0.50、84.83和286倍,PxyChi在成虫的表达量最高.暗示PxyChi蛋白可能参与小菜蛾蛹期旧表皮降解和成虫翅的发育等生理过程.本研究可为探索几丁质酶在小菜蛾发育中的功能提供理论依据.

[目的]表皮蛋白(cuticular proteins,CPs)种类丰富,在昆虫生长发育中起着重要作用.本研究旨在丰富柞蚕Antheraea pernyi体内所含表皮蛋白的类型,探讨不同发育阶段表皮蛋白基因的表达规律.[方法]利用PCR及3'RACE技术从柞蚕幼虫表皮组织中克隆得到两个表皮蛋白基因,并进行生物信息学分析及系统进化分析;半定量RT-PCR检测该基因在柞蚕胚胎发育期的表达规律及在幼虫各组织中的表达分布;实时荧光定量PCR(qPCR)分析该基因在柞蚕不同发育时期及3龄幼虫RNAi后的表达量变化.[结果]克隆获得两个柞蚕表皮蛋白基因并分别命名为ApCP12和ApCP23,GenBank登录号分别为MF318874和MF318875.生物信息学分析表明,ApCP12基因长度为690 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长336 bp,编码111个氨基酸,推测得到的蛋白质分子量为12 kD;ApCP23长度为1 243 bp,ORF长度为594 bp,编码197个氨基酸,相对分子质量为23 kD.两种蛋白都具有RR-1亚族的保守基序,与RR-2亚族表皮蛋白聚类分析位于不同分支.组织特异性表明,ApCP12基因在柞蚕幼虫各组织中的分布比ApCP23更为广泛.柞蚕不同发育时期中,ApCP12在胚胎发育期表达量逐渐升高;幼虫眠起3d内相对于眠期,ApCP12的表达量最高增加了约3倍,而ApCP23的表达量增加了13倍;蛹黑化时期,ApCP12的表达量高于ApCP23;羽化前期,基因的表达量无明显变化,直至羽化前ld,ApCP12和ApCP23的表达量相对于注射蜕皮激素第1天分别增加了3.5和3倍.RNAi处理后,3龄幼虫体内ApCP12的表达量下降了5倍,ApCP23的表达量降低了3倍.[结论]结果提示,RR-1亚族的这两种柞蚕表皮蛋白参与了柞蚕不同发育阶段幼虫表皮、蛹皮、成虫表皮的构建,与柞蚕生长发育的整个生命周期关系密切.