目的:采用生物信息学方法分析老年骨质疏松症相关的核心致病基因及相关通路。方法:于2020年11月至2021年8月，以在北京积水潭医院就诊的8例骨质疏松症病例和5名健康体检者为研究对象。采集8例老年骨质疏松症患者与5名健康体检者的外周血，开展高通量转录组测序，并对表达谱进行分析。对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。通过 STRING、Cytoscape 工具构建 PPI 调控网络、筛选核心基因。结果:8例骨质疏松症病例中，男性1例，女性7例，年龄为（72.4±4.2）岁；5名健康体检者中，男性1名，女性4名，年龄为（68.2±5.7）岁。分析筛选出差异表达基因1 635个，其中847个基因高表达，788个基因低表达。GO富集分析结果显示，差异基因在分子功能方面主要富集于核糖体结构成分、蛋白质二聚化活性等；细胞组分方面主要富集于核小体、DNA组装复合物、胞质部分、蛋白-核酸复合物、游离核糖体等。KEGG信号通路分析结果显示，差异表达基因主要富集于系统性红斑狼疮、核糖体等。筛选出的10个核心基因分别为 UBA52 、UBB、RPS27 A、RPS15 、RPS12 、RPL13 A、RPL23 A、RPL10 A、RPS25和 RPS6，且其中7个基因均可编码核糖体蛋白。 结论:老年骨质疏松症的发病可能与核糖体相关基因和通路有关联。

目的:探讨腺苷酸活化蛋白激酶亚基α2(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2，Prkaa2）与核糖体蛋白S6激酶A1 （ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）的关系及Prkaa2对转化生长因子β1 （transforming growth factor-β，TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞纤维化的影响。方法:用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e细胞制备纤维化的细胞模型。采用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、蛋白质印迹法检测大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52e细胞（对照组）和10 ng/ml TGF-β1诱导12、24、36 h的NRK-52e细胞中Prkaa2的表达水平。于NRK-52e贴壁生长达30%时加入Prkaa2低表达慢病毒，转染72 h后收集细胞，并于Prkka2低表达慢病毒组及Prkaa2空病毒组中用qRT-PCR检测Prkaa2敲减效率。设立TGF-β1诱导、Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导3个实验组，同时以正常未作任何处理的NRK-52e细胞系为对照组。通过蛋白质印迹法检测Prkaa1、Prkaa2、α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、E钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cysteinyl aspartate specific proteinase9，Caspase9）和p53基因（p53）的表达。从Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组中分别选取3个生物学重复样本，通过Affymetrix基因表达谱芯片测序结果筛选差异表达的基因。然后，在Prkaa2RNAi+TGF-β1、Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导2个实验组中验证Prkaa2、Rps6ka1的表达。结果:qRT-PCR及蛋白印迹检测结果显示，TGF-β1诱导12 h时NRK-52e细胞中Prkaa2的mRNA和蛋白的相对表达量分别为1. 368±0. 083和1. 311±0. 007，与对照组1. 000±0. 123和1. 159±0. 009相比，差异有统计学意义（ P<0. 05）。qRT-PCR实验结果显示Prkaa2空病毒组相对表达量为1. 042± 0. 302，较Prkaa2低表达慢病毒组为0. 171±0. 165 ，Prkaa2 mRNA表达下调，差异具有统计学意义（ P= 0. 023）。蛋白质印迹法检测结果显示，TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为2. 89±0. 04，较对照组3. 82±0. 03下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 04±0. 04，较对照组1. 06±0. 05未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；TGF-β1诱导组α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为3. 60±0. 03、1. 07±0. 07、1. 81±0. 02、1. 17±0. 04、0. 62± 0. 01，均较对照组2. 95±0. 04、0. 74±0. 03、1. 00±0. 04、0. 77±0. 05、0. 37±0. 01上调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为3. 57±0. 03，较空病毒+ TGF-β1诱导组3. 04±0. 15上调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 03±0. 05，较空病毒+TGF-β1诱导组1. 05±0. 06未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa2、α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为0. 54±0. 02、3. 21±0. 07、0. 44±0. 03、1. 16±0. 08、0. 94±0. 03、0. 44±0. 03，均较空病毒+TGF-β1诱导组0. 89±0. 01、3. 49±0. 06、0. 98±0. 07、1. 87±0. 02、1. 21±0. 04、0. 65± 0. 03下调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Affymetrix基因表达谱芯片测序结果显示核糖体蛋白S6激酶A1(ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）下调。蛋白质印迹法和qRT-PCR验证结果提示，Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Rps6ka1表达相对表达量为0. 60±0. 02、0. 590±0. 026，较Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组1. 15±0. 04、1. 003±0. 080下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）。 结论:Prkaa2与Rps6ka1存在正向调控关系，抑制Prkaa2可以改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。

为探究核糖体蛋白RPS6 亚基肽段对S180 肿瘤细胞基因表达的影响及抑制肿瘤细胞的关键分子和信号通路,以S180 荷瘤小鼠为模型,用RPS6 亚基肽段处理S180 荷瘤小鼠,对S180 肿瘤细胞进行Illumina测序获得差异表达的基因,并对这些差异基因进行GO和KEGG分析.基因表达结果显示,RPS6 亚基肽段会导致mt-Cytb、mt-Nd1、Rpl13 基因表达降低,阻碍S180 肿瘤细胞的氧化磷酸化过程.GO分析结果显示,RPS6 亚基肽段抑制肿瘤细胞关键门类集中于质膜和质膜外侧组成成分的变化及免疫反应调节和免疫细胞的激活.差异基因结果显示,RPS6亚基肽段通过增强PRL/PRLR信号,上调Uchl1 基因表达,诱导肿瘤细胞周期停滞.KEGG通路富集分析结果显示,穿孔素(PRF1)和颗粒酶B(GZMB)表达诱导细胞凋亡,同时自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)介导的细胞毒性与NF-κB信号通路信号增强,IFN-γ和TNF-α表达上调共同参与RPS6 亚基肽段作用下的S180 肿瘤细胞凋亡,抑制S180 肿瘤细胞增殖.RPS6 亚基肽段导致S180 肿瘤细胞细胞周期停滞,并诱导自然杀伤细胞介导的细胞毒性及NF-κB信号通路的上调导致S180 肿瘤细胞凋亡,为RPS6 亚基肽段在抗肿瘤研究的应用提供一定的理论依据.

目的:网络药理学结合GEO数据集探讨翻白草治疗 2 型糖尿病的分子机制.方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)下载翻白草化学成分信息,经SwissADME对各成分进行筛选和SwissTargetPrediction预测靶点后,得到药物作用靶点.采用R软件下载GEO数据中GSE系列,提取表达矩阵,对原始数据进行归一化处理后提取临床信息,采用limma程序包进行 2 型糖尿病差异基因分析.通过微生信在线平台获取药物作用靶点和疾病差异基因交集,即为翻白草治疗 2 型糖尿病的潜在作用靶点,对潜在作用靶点进行生物信息学分析,采用分子对接方法对分析结果进行验证.结果:筛选得到翻白草中 20 个化学成分,经SwissTargetPrediction预测后,得到374 个药物作用靶点,R软件分析获得 2 型糖尿病差异基因 658 个,取交集后得到 17 个潜在作用靶点.经过基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析可知,翻白草有效成分有原儿茶酸、咖啡酸、山柰酚、3,4,5-三羟基苯甲酸、罗索酸,通过作用蛋白激酶C-θ(PKC-θ)、核转录因子-κB p65 亚单位(RELA)、核糖体蛋白S6 激酶α3(RPS6KA3)、信号传导和转录激活因子 3(STAT3)、乳酸脱氢酶B(LDHB)和 6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶同工酶 3(PFKFB3)靶点,参与胰岛素抵抗通路(P<0.01)、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路(P<0.01)和脂肪细胞因子信号通路(P<0.01)来发挥治疗 2 型糖尿病作用.分子对接结果显示,PKC-θ、RELA、STAT3 与咖啡酸,RPS6KA3 与罗索酸,LDHB与 3,4,5-三羟基苯甲酸,PFKFB3 与山柰酚之间均具有较好的对接活性.结论:通过网络药理学结合GEO数据集,初步预测了翻白草治疗 2 型糖尿病的潜在靶点和可能的作用机制,为翻白草治疗 2 型糖尿病的进一步研究提供理论依据.

木犀草素(luteolin,Lut)对多种肿瘤细的生长具有抑制作用,但对乳腺癌细胞的生物学行为的影响尚不明确,本研究旨在探讨Lut对乳腺癌细胞增殖与侵袭的影响及其作用机制.首先体外培养乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF7),免疫印迹实验检测细胞静息状态下核糖体蛋白S12(ribosomal protein S12,RPS12)表达水平.并采用MTT法、免疫印迹法分别测定不同浓度Lut处理后细胞的增殖水平,胞内RPS12及c-Myc的表达,以及PI3K/Akt、mTOR和S6K的磷酸化.同时采用c-Myc及PI3K/Akt、mTOR抑制剂处理组细胞,分别检测细胞增殖水平以及细胞内RPS12以及c-Myc表达.随后构建RPS12启动子报告基因,研究Lut对其转录的影响.最后在细胞内过表达c-Myc,或采用siRNA沉默RPS12表达,检测细胞侵袭和迁移的变化.结果显示,RPS12在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7细胞系中均呈高水平表达.采用不同浓度Lut处理细胞后,其增殖均明显降低,PI3K/Akt、mTOR及S6K磷酸化水平与对照组相比有所减弱,c-Myc和RPS12表达也显著受到抑制,PI3K/Ak和mTOR抑制剂也具有类似结果.此外,抑制c-Myc后可显著降低乳腺癌细胞内RPS12表达以及转录活性,但细胞过表达c-Myc后RPS12水平显著增高,而沉默RPS12则可以显著抑制细胞的侵袭和迁移.以上结果表明Lut能够抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖与侵袭,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路进而下调c-Myc的表达,最终抑制RPS12表达有关.

目的 探究冬凌草甲素对肝内胆管癌细胞HuCCT1增殖和凋亡的影响.方法 选取HuCCT1细胞随机分为对照组和低、中、高剂量实验组.对照组细胞正常培养,不做任何处理,低、中和高剂量实验组分别以3.75、7.50和15.00μmol·L-1冬凌草甲素处理24 h.用细胞计数实验(CCK-8)检测细胞增殖活性;用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;用蛋白质印迹法检测增殖和凋亡蛋白水平.结果 对照组和低、中、高剂量实验组G2期细胞数量百分比分别为(9.54±0.64)％、(25.39±1.29)％、(30.97±1.03)％和(35.06±4.06)％,凋亡率分别 为(15.94±0.21)％、(16.96±0.88)％、(18.57±0.65)％和(30.61±0.98)％,磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表达水平分别为0.60±0.02、0.41±0.04、0.30±0.05和0.26±0.02,磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达水平分别为 0.28±0.01、0.26±0.01、0.13±0.02 和 0.12±0.01,磷酸化 S6 核糖体蛋白(p-RPS6)分别为 0.32±0.02、0.28±0.01、0.17±0.01 和0.10±0.01.低、中和高剂量实验组上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 冬凌草甲素具有抑制HuCCT1细胞增殖并诱导其凋亡的作用,其机制可能与冬凌草甲素调控AKT/mTOR信号通路有关.

核糖体蛋白S6激酶β1(Ribosomal protein S6 kinaseβ1,RPS6KB1)是一个有价值的肝癌诊断和预后标志物,也是一个潜在的基因治疗分子靶点,但其致癌机制和预后价值仍未完全阐明.为了全面认识RPS6KB1,本文使用生物信息学手段,对RPS6KB1蛋白的序列同源性、组织表达、亚细胞定位、理化性质、空间结构及蛋白质相互作用网络进行分析.结果表明人RPS6KB1基因编码525个氨基酸组成的多肽,在进化过程中高度保守,属于PKc like超家族,是酸性不稳定的亲水蛋白,无信号肽和跨膜区域.该蛋白定位于细胞核的可能性最大,主要二级结构为随机卷曲,存在磷酸化、乙酰化和泛素化位点.与RPS6KB1相互作用的蛋白主要是mTOR信号途径相关蛋白、PI3K信号途径相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白以及调控胰岛素水平相关蛋白.本文结果为进一步研究RPS6KB1的功能及致癌机制提供一定的参考.

目的 观察干扰谷氨酰胺酶1(GLS1)表达对人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞生物学特性的影响.方法 Western blot检测GLS1在人胃肠道神经内分泌肿瘤中的表达;将正常对照(NS)-小干扰RNA (siRNA)、GLS1-siRNA1、GLS1-siRNA2、GLS1-siRNA3转染人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株BON-1,未转染任何siRNA的作为对照组,Westem blot检测转染后各组细胞中GLS1蛋白表达;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测转染12、24、48 h后细胞增殖;细胞转染24 h后,Transwell小室检测细胞侵袭数;Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR (p-mTOR)、人核糖体蛋白S6激酶(rps6k)、磷酸化rps6k (p-rps6k)蛋白表达;细胞中加入10 nmol/L mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素,检测其对细胞增殖侵袭的影响.结果 GLS1在人胃肠道神经内分泌肿瘤组织中的表达显著高于瘤旁组织(P=0.000);GLS1-siRNA1、GLS1-siRNA2、GLS1-siRNA3组细胞中GLS1蛋白表达水平均显著低于对照组,选择GLS1-siRNA2作为后续研究;GLS1-siRNA组在12、24、48 h的细胞存活率为(85.31±4.42)％、(76.12±2.93)％、(69.22±3.62)％,均显著低于对照组[(97.02±2.21)％、(96.61±1.52)％、(97.11 ±2.32)％;t12 h =4.104,P12 h =0.015;t24 h=10.752,P24 h=0.000;t4s h=11.235,P48 h=0.000];GLS1-siRNA组细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、p-mTOR、p-rps6k蛋白表达水平均显著低于对照组;加入抑制剂后的细胞增殖及侵袭结果与干扰GLS1表达的结果趋势一致.结论 GLS1在人胃肠道神经内分泌肿瘤中呈高表达,抑制GLS1的表达能显著抑制BON-1细胞增殖和侵袭,其机制与mTOR信号通路的调控有关.

核糖体蛋白S13(Ribosomal protein S13,RPS13)属于核糖体蛋白家族,在核糖体中的生物学功能主要是维持核糖体大小亚基之间的动态连接.从蛇床子[Cnidium monnieri(L.)Cuss.]的根、茎、叶组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增蛇床子核糖体蛋白s13(rps13)的开放阅读框(ORF),成功获得了一段453 bp的基因,该基因片段编码151个氨基酸的蛋白;将获得的目的基因rps13 ORF连接到表达载体pET22b(+)中,并进一步转化到大肠杆菌表达菌中诱导目的基因体外表达;通过对蛋白结构进行分析表明蛇床子RPS13含有6个 α 螺旋;对蛇床子RPS13进行系统进化分析表明该蛋白在进化上具有高度保守性,与植物类胡萝卜的RPS13亲缘关系最近.蛇床子RPS13蛋白在体外的成功表达以及对其进行系统的生物信息学分析为进一步深入研究该蛋白的结构和功能奠定了理论基础.

目的:探讨洋椿苦素对骨关节炎的治疗效果及其作用机制.方法:使用软骨细胞系C28/I2作为体外研究对象,采用MTT法检测洋椿苦素的细胞毒性,使用Western blot和免疫荧光检测洋椿苦素对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin,mTOR)的抑制作用和对自噬的激活效果;选用C57BL/6J小鼠(n=40)建立右膝骨关节炎模型,同只小鼠的左膝作为正常对照,经腹腔分别给以洋椿苦素(n=20)和生理盐水(n=20)治疗后,利用Western blot、免疫组化、免疫荧光、番红O染色、HE染色、软骨损伤半定量评分系统及炎症分级系统,检测洋椿苦素对mTOR的抑制效果、自噬的激活情况、对软骨的保护和滑膜炎症抑制的效果.结果:①洋椿苦素可抑制C2882细胞mTOR的Ser-2448磷酸化位点,同时抑制核糖体S6蛋白激酶磷酸化(ribosomal protein S6,rpS6)的Thr-389和Ser-371位点,其最佳剂量为40 μmol/L(Ser-2448:t=13.42,P=0.000;Thr-389:t=19.06,P=0.000;Ser-371:t=9.52,P=0.000),最佳作用时间为24h(Ser-2448:t=34.82,P=0.000;Thr-389:t=3.14,P=0.007;Ser-371:t=19.32,P=0.000);②洋椿苦素可促进C28/I2细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值(t=8.15,P=0.002),并增加自噬小体阳性细胞的数量(t=9.71,P=-0.000);③在骨关节炎中,洋椿苦素可抑制mTOR的磷酸化水平(t=19.03,P=0.005)及rpS6表达阳性的细胞数量(t=27.97,P=0.000),并增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平(t=24.65,P=0.000)和LC3表达阳性的细胞数量(t=33.89,P=0.000);④洋椿苦素可降低骨关节炎模型中关节软骨的损伤程度(t=8.32,P=0.009),增加软骨细胞的密度(F=3.59,P=0.013),抑制具有Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type Ⅰ motifs5,ADAMTS-5)的表达(F=1.82,P=0.002);⑤在骨关节炎模型的滑膜组织中,洋椿苦素可通过对白介素-1β (Intedeukine-1 beta,IL-1β3)的抑制(F=3.20,P=0.000)从而抑制滑膜组织中的炎症反应(F=5.44,P=0.029).结论:洋椿苦素作为一种潜在的mTOR抑制剂,在小鼠模型中可通过激活自噬降低关节软骨的损伤并保护软骨细胞,还可通过对ADAMTS-5和IL-1β3的抑制实现对细胞外基质的保护和炎症的抑制,但对骨关节炎中软骨的损伤的保护效果及机制还需进一步研究.