目的:探讨氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法:自C57BL/6小鼠（6 ~ 8周）股骨分离、培养得到BMSCs，取第3代细胞采用流式细胞术分析干细胞表面标志物。用氟终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L的培养基培养BMSCs，检测不同浓度氟对BMSCs细胞增殖（CCK8法）、凋亡（流式细胞术分析）、成骨分化能力[茜素红及碱性磷酸酶（ALP）染色]的影响；采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白[聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）]、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路成员蛋白[细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2），c-Jun氨基末端激酶（JNK），p38及磷酸化ERK、JNK、p38（p-ERK、p-JNK、p-p38）]，成骨分化相关蛋白[Runt相关转录因子2（Runx2）、ALP]与Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路成员蛋白[糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）及β-catenin]的表达水平；并采用免疫荧光染色分析p-GSK3β及β-catenin的表达情况；使用SP600125及DKK-1分别阻断MAPK和Wnt/β-catenin 2个信号通路后，分析细胞凋亡及成骨分化等的变化。结果:成功分离、培养出小鼠BMSCs，流式细胞术分析显示，间充质干细胞表面标志分子CD73、CD90、CD105均呈阳性。各浓度组3个时间点（24、48、72 h）细胞增殖情况比较差异均有统计学意义（ F = 65.36、160.04、365.32， P均< 0.001），各浓度组细胞早期凋亡情况（24 h）比较差异有统计学意义（ F = 214.04， P < 0.001）；与0.0 mg/L氟浓度组比较，15.0、20.0、40.0 mg/L氟浓度组细胞增殖水平均降低，10.0、15.0、20.0 mg/L氟浓度组细胞早期凋亡率均增高（ P均< 0.05）。15.0 mg/L氟处理细胞0 ~ 24 h，p-JNK/JNK比例在2、4、8、12、18、24 h时间点均高于0 min（ P均< 0.05）；与单独氟处理组（15.0 mg/L）比较，SP600125阻断后细胞早期凋亡率降低（ P < 0.05），PARP及p-JNK蛋白表达水平均降低（ P均< 0.05）。成骨诱导后，与0.0 mg/L氟浓度组比较，0.1、1.0 mg/L氟浓度组ALP染色增强、矿化结节数量增多；且0.1、1.0 mg/L氟浓度组Runx2及ALP蛋白表达水平均较高（ P均< 0.05）。成骨诱导后，与0.0 mg/L氟浓度组比较，0.1、1.0 mg/L氟浓度组p-GSK3β/GSK3β比例及β-catenin蛋白表达水平均较高（ P均< 0.05）；与单独氟处理组（1.0 mg/L）比较，DKK-1阻断后p-GSK3β及β-catenin蛋白表达水平均较低（ P均< 0.05），β-catenin入核减少，ALP染色减弱，矿化结节数目减少。 结论:高浓度氟（> 10.0 mg/L）抑制BMSCs增殖、促进凋亡，而低浓度氟（0.1、1.0 mg/L）促进细胞成骨分化。MAPK/JNK通路与Wnt经典通路分别参与了上述细胞过程。

目的:探讨小干扰RNA（siRNA）沉默烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）基因表达对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制。方法:在体外合成针对NAMPT基因的siRNA并转染U266细胞，实验分为si-NAMPT组（转染siRNA-NAMPT的U266细胞）、si-NC组（转染阴性对照siRNA的U266细胞），采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测转染后U266细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，蛋白质印迹法检测转染后各组细胞NAMPT、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、β-catenin表达水平。结果:si-NAMPT组转染48、72 h后与si-NC组比较，对U266细胞增殖抑制作用（570 nm处吸光度值）增加（48 h：0.78±0.06比1.62±0.11；72 h：1.23±0.14比2.37±0.18），差异均有统计学意义（ t=3.54， P=0.034； t=4.72， P<0.01）。si-NAMPT组与si-NC组相比，细胞早期凋亡率升高[（53.42±0.25）%比（25.98±3.18）%]，差异有统计学意义（ t=4.41， P<0.01）。与si-NC组相比，si-NAMPT组p-AKT、p-GSK-3β、NAMPT、β-catenin蛋白水平均降低（均 P<0.05）。 结论:沉默NAMPT基因可明显抑制U266细胞增殖并诱导细胞凋亡，其可能通过抑制AKT-GSK-3β-β-catenin信号通路发挥作用。

目的 探讨小胶质细胞及星形胶质细胞中的瞬时受体电位M2 型(TRPM2)离子通道在颞叶癫痫(TLE)相关神经炎症中的作用.方法 将大鼠随机分为对照组和癫痫组,癫痫组采用氯化锂-毛果芸香碱(匹罗卡品)制作癫痫模型,对照组给予等剂量的生理盐水代替,根据造模后观察的时间将TLE大鼠随机分为 7 个亚组(n = 5):急性期(3 h组、6 h组、1 d组、2 d组)、潜伏期(14 d组)、慢性期(30 d组、90 d组).检测TRPM2 在不同亚组TLE大鼠海马中的表达及TRPM2 在大鼠海马中的细胞定位情况.采用过氧化氢(H2O2)诱导小胶质细胞BV2 及星形胶质细胞C8 细胞系,检测细胞释放IL-1β、IL-6 和TNF-α的水平,检测H2O2 诱导的BV2 及C8 细胞中TRPM2、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)、糖原合成酶激酶 3β(GSK-3β)、磷酸化核因子κB p65 蛋白(p-NF-κB p65)的表达变化,同时检测H2O2 诱导BV2 细胞中钙调神经磷酸酶(CaN)的活性变化.结果 急性期TLE大鼠海马中的TRPM2 表达升高(P<0.05).H2O2 诱导的BV2 及C8 细胞中TRPM2 的表达升高、炎症因子释放增加(P均<0.05),H2O2 可促进BV2 细胞中PARP-1、p-NF-κB p65 的表达并提高CaN、GSK-3β的活性(P均<0.05).结论 氧化应激可促进小胶质细胞及星形胶质细胞TRPM2 及促炎细胞因子的表达,癫痫反复发作引起的氧化应激可能在小胶质细胞中通过TRPM2/CaN/p-NF-κB p65 通路介导TLE相关神经炎症的发生.

目的 筛选核糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/程序性死亡配体1(PD-L1)双靶点抑制剂,并预测其活性.方法 采用药效团模型和分子对接方法筛选ChemDiv数据库,得到排序靠前的化合物,并通过定量构效关系(QSAR)模型预测其活性.结果 得到了 4个化合物,其药效团Fitvalue以及分子对接打分均接近或高于各自的阳性对照化合物,QSAR模型预测表明:两者对GSK3β/PD-L1的潜在抑制效力较为均衡.结论 获得了 4个具有全新骨架结构的化合物,为开发GSK3β/PD-L1双靶点抑制剂提供了先导化合物.

目的 观察抗凋亡蛋白抑制剂ABT-263对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞功能的影响,并探讨相关分子机制.方法 ①取对数生长期的人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)与A431细胞提取总蛋白,采用蛋白印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)和BCL-XL的蛋白表达水平.②分别以浓度为50 μmol/L的ABT-263(抑制剂组)和二甲基亚砜(对照组)处理A431细胞,培养4和9h后,采用透射扫描电子显微镜(TEM)检测各组细胞的形态变化.③以剂量为0、10、25、40和50 μmol/L的ABT-263处理A431细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力.④以不同剂量的ABT-263处理A431细胞,采用蛋白印迹法检测活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、活化聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)ser473、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(pGSK3β)和磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的蛋白相对表达水平.结果 A431细胞中的BCL-2和BCL-XL蛋白相对表达水平均高于HaCaT细胞(P＜0.01).TEM检查结果显示,抑制剂组A431细胞从正常的形态逐渐变化为凋亡的形态,表现为微绒毛消失,核染色质密度增高并凝聚在核膜周边,核仁裂解.10、25、40和50 μmol/L剂量组A431细胞的细胞活力均低于对照组(P＜0.05).10、30和50 μmol/L剂量组A431细胞的活化Caspase-3和活化PARP-1蛋白的相对表达水平均高于对照组(P＜0.05).10、25、40、50 μmol/L剂量组A431细胞的pAKT(ser473)和pGSK3β的蛋白相对表达水平均低于对照组(P＜0.05),γH2AX蛋白相对表达水平高于对照组(P＜0.05).A431细胞活力和pGSK3β蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而减少(P＜0.01),活化Caspase-3和γH2AX的蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而增加(P＜0.01),均呈剂量-效应关系.结论 ABT-263可诱导A431细胞发生线粒体途径的凋亡,并可诱导AKT/GSK3β信号通路失活,从而促进A431细胞凋亡,呈一定程度的剂量-效应关系.

目的 探讨药物相关分子靶标检测在儿童颅外恶性实体瘤个体化治疗中的作用和意义.方法 将2011年4月至2013年4月期间于上海交通大学医学院附属新华医院治疗的38例难治性儿童颅外恶性实体瘤的手术标本及外周血,通过免疫组织化学、酶联免疫吸附试验、荧光原位杂交、聚合酶链式反应扩增和测序的方法检测肿瘤药物相关分子靶标.共检测15种化疗药物和2种靶向药物的基因表达或突变.结果 入组的38例标本中,35例为手术标本,其中3例为二次手术标本、3例为外周血标本送检肿瘤药物相关分子靶标.检测了肿瘤标本化疗药物分子靶点DNA拓扑异构酶ⅡA(TopoⅡA)34例、微管蛋白β3(Tubulinβ3) 32例、人切除修复交叉互补基因1(ERCC1) 28例、DNA拓扑异构酶Ⅰ(TOPO Ⅰ)28例、DNA修复蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT) 20例、胸苷酸合成酶(TS) 13例、核糖核苷酸还原酶M1 (RRM1)6例.68.75％对氟尿嘧啶及培美曲赛敏感,66.67％对吉西他滨敏感,56.25％对长春碱类敏感;而67.65％对蒽环类/依托泊苷敏感性低,64.29％对铂类药物、拓扑替康/伊立替康敏感性低,63.64％对替莫唑胺敏感性低.外周血标本化疗药物分子靶点33例CYP2C9*3、14例二氢叶酸还原酶(DHFR C829T)基因多态性PCR测序,结果显示100.00％和93.33％对环磷酰胺和甲氨蝶呤敏感;用外周血标本化疗药物分子靶点检测肿瘤化疗药物毒性反应情况,结果 显示100.00％环磷酰胺及甲氨蝶呤毒副反应弱,76.19％伊立替康/依托泊苷毒副反应弱;肿瘤标本靶向药物基因血管内皮生长因子受体-2 15例、表皮生长因子受体(EGFR)5例和外周血标本细胞间黏附分子-1检测10例,显示68.00％对贝伐珠单抗敏感,EGFR 5例都无扩增,对络氨酸激酶抑制剂无效.依据上述检测结果,对标准化疗方案疗效欠佳的患儿,及时调整治疗策略后,取得了初步效果.结论 本研究首次在儿童颅外恶性实体瘤的治疗中引入药物相关性分子靶标的检测,对于开展规范化治疗基础上的个体化治疗方案的选择及药物毒副作用的预测,提供了实验室依据.

目的:探讨清心开窍方对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力、海马CA1区神经元形态学的改变,以及对Akt、GSK3α、βAPP、Aβ蛋白表达的影响.方法:选取50只3月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠,随机分为模型组、多奈哌齐组(1.67 mg·kg-1)、清心开窍方高、中、低剂量组(每日给药剂量分别为19、9.5、4.75 g·kg-),另取10只同背景同性别同月龄的C57BL/6J小鼠作为对照组,对照组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,1次/d,连续灌胃12周.采用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力,透射电镜观察小鼠海马CA1区神经元超微结构,尼氏染色法观察小鼠海马CA1区神经元损伤情况,免疫组织化学染色法检测海马CA1区Akt、GSK3α、βAPP、Aβ蛋白的表达情况.结果:与对照组比较,模型组APP/PS1双转基因小鼠逃避潜伏期延长(P＜0.01),穿台次数减少,其海马CA1区神经元超微结构出现严重损伤,锥体细胞数量减少,排列紊乱,尼氏体着色变浅,Akt蛋白表达减少(P＜0.01),GSK3α、βAPP、Aβ表达增加(P＜0.01);与模型组比较,清心开窍方干预组逃避潜伏期均明显缩短(P＜0.01),穿台次数增多,同时比较小鼠在原平台停留的时间和路程百分比均明显增加(P＜0.05;P＜0.01),其神经元结构较完整,核膜清晰,胞浆内核糖体丰富,线粒体数量增多,且嵴结构完整,锥体细胞数量增多,排列紧密,尼氏体着色较深,同时Akt蛋白表达增加(P＜0.01;P ＜0.05),GSK3α、βAPP、Aβ表达减少(P＜0.01;P＜0.05).结论:清心开窍方能够改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力,其机制可能与Akt/GSK3α介导的信号通路相关,它能够激活Akt,抑制GSK3α,降低βAPP、Aβ的生成,减少神经元损伤.

目的 探讨程序性细胞凋亡因子4(PDCD4)表达下调在顺铂诱导胃癌细胞凋亡中的作用机制,为胃癌的顺铂耐药提供新的分子靶点.方法 通过在人胃癌细胞系SGC7901中敲减表达PDCD4基因,顺铂诱导细胞凋亡,将细胞分为shNC组、shPDCD4组、shNC加药组和shPDCD4加药组,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测PDCD4 mRNA表达水平;Caspase-3活性测定试剂盒、Hoechst染色结合细胞免疫荧光检测细胞凋亡水平;Western blot检测磷酸化蛋白激酶B (pAKT)和磷酸化糖原合成酶激酶3β(pGSK3β)蛋白表达水平.在细胞中加入特异性Akt抑制剂,将细胞分为shNC加药组、shPDCD4加药组、LY294002阻断组(转染shPDCD4质粒,先加LY294002再加入顺铂处理)和Wortmannin阻断组(转染shPDCD4质粒,先加Wortmannin再加入顺铂处理),Western blot检测聚ADP-核糖聚合酶(PARP)蛋白表达水平.结果 qRT-PCR和Western blot检测结果证实稳定转染ShPDCD4质粒的SGC7901细胞中PDCD4的mRNA表达和蛋白表达均有显著下降,体外稳定转染ShPDCD4的SGC7901胃癌细胞株构建成功.相较于shNC加药组,shPDCD4加药组Caspase3活性下降,细胞凋亡降低(P＜0.05).PDCD4表达下调将导致pAKT和pGSK3β的表达水平提高(P＜0.05),应用Akt抑制剂(LY294002、Wortmannin)阻断该信号通路后,PARP的相对表达水平重新上调(P＜0.05).结论 PDCD4表达下调能够通过pAKT/pGSK3β途径降低顺铂引起的胃癌细胞凋亡,进而促进细胞顺铂耐药的形成.

目的:构建形觉剥夺性近视(FDM)大鼠模型,阐明FDM大鼠巩膜成纤维细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及其与Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的关系.方法:40只大鼠随机分为对照组和FDM模型组,每组20只,FDM模型组大鼠建立FDM模型.测定大鼠眼轴长度;取大鼠眼球分离巩膜组织,采用Western blotting法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定大鼠巩膜组织中TGF-β1蛋白和mNRA表达水平.分离培养对照组和FDM模型组大鼠巩膜成纤维细胞,对照组大鼠巩膜成纤维细胞作为对照组,FDM模型组大鼠巩膜成纤维细胞分为FDM组和FDM+Dickkopf相关蛋白1(DDK1)组(加入DDK1培养),采用Western blotting法和RT-PCR法测定各组大鼠巩膜成纤维细胞中TGF-β1、3型核糖核酸酶(DCL3)、结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、p21-GSK3β和β-catenin蛋白及mRNA表达水平.结果:与对照组比较,FDM组大鼠眼轴长度均明显增加(P<0.05),巩膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA表达水平均明显降低(P<0.01).对照组、FDM组和FDM+DDK1组大鼠巩膜成纤维细胞中GSK3β蛋白和mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),TGF-β1、DCL3、APC、p21-GSK3β和β-catenin蛋白及mRNA表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01);与对照组比较,FDM组大鼠巩膜成纤维细胞中TGF-β1、APC蛋白和mRNA表达水平降低(P<0.05),DCL3、p21-GSK3β、β-catenin蛋白和mRNA表达水平升高(P<0.05);与FDM组比较,FDM+DDK1组大鼠巩膜成纤维细胞中TGF-β1、APC蛋白和mRNA表达水平升高(P<0.05),DCL3、p21-GSK3β、β-catenin蛋白和mRNA表达水平降低(P<0.05).结论:FDM模型大鼠巩膜成纤维细胞中TGF-β1表达水平降低,其水平受Wnt/β-catenin信号通路调控.

背景与目的:3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent kinase-1,PDK1)在细胞的生长、增殖及存活中具有重要的生理作用,其功能异常参与多种肿瘤的发生.探讨PDK1在慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)细胞中的表达及参与细胞凋亡的调节机制.方法:通过蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白水平;通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)及克隆形成实验检测细胞增殖;通过流式细胞术检测细胞凋亡.结果:CML患者外周血白细胞中PDK1蛋白含量明显高于健康体检者(P<0.05);在细胞株中,抑制PDK1能明显降低K562和KU812的增殖活力及克隆形成能力;同时,细胞凋亡明显(P<0.01),凋亡执行分子caspase-3及底物多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]被切割活化.抑制剂GSK2334470降低PDK1的磷酸化水平(K562:P<0.05;KU812:P<0.01),但并不影响其表达丰度.蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及下游糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)磷酸化水平均明显下降,然而β-catenin及靶基因c-Myc表达均未受影响(P>0.05).磷酸化凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)水平降低(P<0.001),下游c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及Bcl-2相互作用细胞凋亡介导因子(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)磷酸化水平明显升高,同时,Bim表达量也有所增加.最后,抑制PDK1能够增加CML细胞对伊马替尼(imatinib)的敏感性,与imatinib单独作用相比,联合GSK2334470能够显著提高细胞凋亡水平(P<0.01).结论:PDK1抑制剂GSK2334470通过调节ASK1/JNK/Bim信号通路磷酸化水平激活CML细胞凋亡.