目的 通过计算机虚拟筛选从HERB数据库草药成分中筛选出靶向新型冠状病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)、木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLpro)和受体结合域(receptor binding domain,RBD)的新型潜在抑制剂并阐述其相互作用机制.方法 以从HERB数据库中获得的天然化合物为筛选对象,综合运用药效团模型、分子对接、ADME-T预测、分子动力学模拟和分子力学泊松-玻尔兹曼表面积(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area,MM-PBSA)等计算方法,获取靶向新型冠状病毒中Mpro、PLpro和RBD等多个靶点的潜在抑制剂,并采用酶活性抑制实验评价其植物提取物对 Mpro 的抑制效果.结果 化合物 HBIN006454、HBIN032286 和 HBIN031053 对 SARS-CoV-2 的 Mpro、PLpro 和 RBD 靶点均具有较高的结合亲和力.其中,巴戟天中的HBIN031053具有更好的类药性和药动学特性,且与各靶点所形成的复合物在分子动力学模拟中均表现出良好的稳定性.MM-PBSA分析结果进一步揭示了在HBIN031053-Mpro、HBIN031053-PLpro以及HBIN031053-RBD的结合中发挥关键作用的氨基酸残基,并深入阐述了其抑制病毒蛋白酶活性的机制.酶活性抑制实验表明,巴戟天提取物对Mpro有抑制效果.结论 天然化合物HBIN031053可作为靶向SARS-CoV-2中Mpro、PLpro和RBD等靶点的潜在新型抑制剂.

目的 设计DPP-4和SGLT-2 双靶点抑制剂.方法 根据现有的DPP-4和SGLT-2 活性化合物训练BiRNN模型,使其生成具有潜在活性的双靶点新分子,并使用已经报道的活性化合物构建HipHop药效团模型,通过药效团模型对新分子进行初筛,然后使用分子对接、分子动力学模拟以及结合自由能计算等方法对初筛小分子进行进一步筛选最终得到候选化合物.结果 BiRNN模型生成 7 494 个新分子,经过虚拟筛选发现化合物NM186、NM21、NM249、NM107 是相对理想的DPP-4 和SGLT-2 双靶点抑制剂.结论 NM186、NM21、NM249、NM107 可能是一种具有新型结构的DPP-4/SGLT-2 双靶点抑制剂,这一研究丰富了DPP-4和SGLT-2 双靶点抑制剂的多样性,为其开发提供新的设计思路.

采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap-HRMS)联用技术对灵芝醇提物的化学成分进行系统分析,总结其代表性化学成分的裂解规律,并对灵芝潜在作用于法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)靶点的抗肝纤维化活性物质进行研究,阐明其药效物质基础.初步鉴定出灵芝醇提物95种化学成分,包括灵芝酸类24种、灵芝烯酸类9种、赤芝酸类13种、丹芝酸类3种、灵芝内酯类1种、其他三萜类成分40种、脂肪酸类成分4种、其他类1种,并分析了其裂解规律.如灵芝酸、灵芝烯酸类成分的结构特征以C30为骨架,含有游离的-COOH及-OH,易失去H2O、CO2分子形成碎片离子,D环多为五元环,易发生断裂;赤芝酸类成分属于C27骨架的羊毛甾烷型,与灵芝酸类成分相比其侧链结构变短,由8个碳减少为5个,同灵芝酸类含有常见的游离-COOH、-OH,容易失去H2O、CO2分子.通过选取已报道的6种FXR受体激动剂组成训练集,建立基于FXR配体的药效团模型,以鉴定出的95种灵芝化学成分与药效团进行匹配,通过测试集分子对模型进行验证,选出最优药效团模型02(敏感性=0.750 00,特异性=0.555 56,ROC=0.750)用于对灵芝化合物库的虚拟筛选,经匹配筛选得到31种潜在的可用于激活FXR的灵芝活性成分,随后ADMET预测结果表明灵芝酸H和赤芝酸J与血浆蛋白的结合率低于90％,且无肝毒性,可作为FXR激活剂开发单用或联用治疗肝纤维化的临床药物.

目的 筛选具有PPARδ激动活性的化合物.方法 通过构建PPARδ药效团模型对Top Science数据库中的780万个小分子进行筛选,并采用对接分析通过化合物与受体之间的结合作用模式及其靶点选择性进行筛选;通过分子动力学模拟的方法,确定苗头化合物,进而通过体外活性实验获得PPARδ激动剂.结果 通过计算机虚拟筛选获得了 24个潜在PPARδ激动剂,分子对接结果表明,化合物3、5、9为潜在的PPARδ选择性激动剂.体外激动活性实验表明化合物3、5、9具有一定的PPARδ激动活性.结论 与化合物3、5相比,化合物9拥有更强的体外激动活性(EC50=17.66 μmol·L-1),后续可进行结构迭代优化,为进一步开发PPARδ激动剂奠定了基础.

[目的]开发针对头孢噻肟-水解酶-14(CTX-M-14)型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)的抑制剂,用以缓解细菌耐药带来的严重危害.[方法]使用DiscoveryStudio Visualizer(DS Visualizer)构建基于受体结构的药效团模型(structure-based pharmacophore,SBP)和基于配体共同特征的定性药效团模型(common feature pharmacophore generation,HIPHOP),并将验证后的模型作为查询条件对ZINC数据库进行以CTX-M-14 蛋白为靶标的虚拟筛选,得到拟合分数良好的中药单体成分甘草酸(glycyrrhizic acid,GL),对其进行相关作用力分析、分子动力学模拟和结合自由能计算,分析甘草酸与CTX-M-14 蛋白的结合模式、结合能力及稳定性;最后通过联合抑菌试验及酶动力学试验考察甘草酸的抗菌增敏活性、抑酶作用及抑酶方式.[结果]中药单体成分甘草酸主要与CTX-M-14 蛋白活性中心多个氨基酸残基形成氢键和范德华作用力,两者的对接分数与结合自由能分别为-10 kcal/mol及-22.06 kcal/mol;甘草酸与头孢噻肟钠联用呈协同作用(FICI≤0.5);甘草酸可竞争性抑制β-内酰胺酶对底物抗生素的水解作用,对头孢噻肟钠的抑酶保护率可达 58.53%,与克拉维酸接近(60.98%).[结论]中药单体甘草酸可与CTX-M-14 蛋白稳定结合,通过竞争性抑制β-内酰胺酶对底物抗生素的水解作用,提高多重耐药大肠杆菌E320 和重组蛋白阳性菌BL-21 对头孢噻肟钠的敏感性,实现抗生素的减量增效.

目的 对"远志-酸枣仁"中潜在作用于钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMK Ⅱ)靶点的活性物质进行筛选,阐明其药效物质基础.方法 采用以药效团为基础的虚拟筛选手段,通过收集已出版文献中报道的具有调控CaMK Ⅱ作用的化合物信息,建立基于CaMK Ⅱ配体的HipHop药效团模型,收集文献中报道的"远志-酸枣仁"中的成分并建立化合物库,对"远志-酸枣仁"中的成分与药效团进行匹配,随后使用分子模拟对接手段对匹配到的小分子化合物与CaMK Ⅱ靶点(PDB ID:2V7O)进行对接,研究潜在活性单体与CaMK Ⅱ的作用.用戊四唑(pentylenetetrazol,PTZ)点燃模型对活性单体细叶远志苷A(39)的抗癫痫作用进行测定,并对CaMK Ⅱ水平的调控作用进行评价.结论 通过文献检索建立包含"远志-酸枣仁"中109种化学成分的化合物库,通过测试集验证确定将药效团03用于对"远志-酸枣仁"化合物库的虚拟筛选,对匹配度排前6位的单体通过分子模拟对接分析其与CaMK Ⅱ的作用情况,并用抗癫痫动物模型对单体的活性进行评价,化合物39能够在中高剂量下延长PTZ致癫痫发作的潜伏时间,改善PTZ所致的焦虑抑郁样行为,改善PTZ诱导的癫痫发作后脑内尼氏体丢失,提升PTZ所致的CaMK Ⅱ表达水平降低,提升海马CA1、CA3区及颞叶皮层内CaMK Ⅱ免疫阳性细胞数量并进一步对nAChR4受体水平进行调控.表明基于虚拟筛选与活性评价手段探讨"远志-酸枣仁"中CaMK Ⅱ调控作用的成分具有一定的准确性.

目的 探究一贯煎多糖(YGJP-W)的基本结构特征以及其改善四氯化碳(CC14)诱导小鼠肝纤维化的活性,分析YGJP-W抗肝纤维化活性与其调节肠道菌群结构变化关系.方法 采用水提醇沉和弱阴离子交换色谱制备一贯煎多糖组分YGJP-W,依次采用苯酚-硫酸法、间羟基联苯法、BCA蛋白定量分析试剂盒、高效凝胶渗透色谱法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)、FT-IR、离子色谱仪及扫描电镜法(scanning electron microscope,SEM)对一贯煎多糖的总糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量、相对分子质量分布、官能团、单糖组成及形貌特征进行表征,采用CCl4诱导的小鼠模型,检测YGJP-W(50、100 mg/kg)干预3周后的小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及肝组织羟脯氨酸水平,并通过HE染色和天狼猩红染色观察肝脏组织学变化,评价YGJP-W改善肝纤维化活性;采用16SrDNA测序技术评价YGJP-W对小鼠肠道菌群的影响;采用抗生素联合YGJP-W干预,评价YGJP-W是否通过调节肠道菌群发挥药效作用.结果YGJP-W总得率为11.60％,总糖质量分数为92.48％,至少由相对分子质量为1.74×105和5.6×103的2种多糖组成,单糖组成包含半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖,其物质的量比为1.0∶2.8∶1.4∶1.6.YGJP-W干预3周后,能够显著改善CC14引起的肝功能异常、肝组织病理损伤、胶原沉积和纤维化.YGJP-W在改善肝纤维化的同时能够引起小鼠肠道菌群结构变化,在门水平上,YGJP-W显著性降低拟杆菌门丰度[(57.4±14.6)％vs(79.3±8.1)％,P＜0.01],增加变形菌门[(10.4±4.7)％vs(2.1±1.9)％,P＜0.01]和放线菌门[(3.7±2.4％)％vs(0.3±0.1)％,P＜0.01)]丰度,在属水平上,YGJP-W增加狄氏副拟杆菌属Parabacteroides、埃希氏菌-志贺氏菌属Escherichia-Shigella、活泼瘤胃球菌属Ruminococcus_gnavus_group、萨特氏菌属Sutterella、毛螺菌属NK4A136组Lachnospiraceae_NK4A136_group和梭杆菌属Fusobacterium共6个菌属的丰度(LDA score＞3,P＜0.01),降低拟普雷沃氏菌属Alloprevotella),肠鼠杆菌属Muribaculum,普雷沃氏菌属UCG-001 Prevotellaceae_UCG-001和另枝杆菌Alistipes共4个菌属的丰度(LDA score＞3,P＜0.01).抗生素联合YJGP-W干预,YJGP-W抗肝纤维化的活性显著减弱.结论 多糖类成分YJGP-W是一贯煎抗肝纤维化的重要物质基础,YJGP-W发挥抗肝纤维化的作用可能与其调控肠道菌群相关.

目的 基于分子模拟技术筛选具有潜在治疗非小细胞肺癌的ROS1激酶抑制化合物.方法 本研究构建了肉瘤致癌因子ROS1受体及其抑制剂之间的药效团模型,通过化合物数据库筛选、分子对接、分子动力学模拟等方法,找到一种具有抑制ROS1功能的先导化合物,最后对该抑制剂的先导化合物与受体蛋白结合作用的模式进行了分析.结果 筛选得到的75号化合物在与ROS1蛋白的分子动力学模拟过程中,显示出了比较稳定的相互作用.结论 75号化合物可以作为潜在的抑制ROS1的先导化合物.

目的 基于Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠模型和网络药理学方法探讨痹祺胶囊的药效作用及作用机制.方法 SD大鼠采用Ⅱ型胶原蛋白造模,造模成功大鼠随机分为模型组,痹祺胶囊(0.05、0.10、0.20、0.40g/kg)组及泼尼松(10mg/kg)组和雷公藤总苷(10mg/kg)组,连续给药15d.持续监测大鼠体质量、足趾肿胀度和关节炎评分,苏木素-伊红染色考察大鼠踝关节病理变化,ELISA法测定血清细胞因子含量,初步评价痹祺胶囊治疗效果.选择痹祺胶囊中39个化合物为研究对象,依据反向药效团匹配方法和TCMSP、Uniprot等数据库预测化合物作用靶点,与通过OMIM、DisGeNet等数据库收集的RA相关靶点相互交互,将交互靶点借助Omicsbean、STRING等数据库平台对获得靶点进行基因本体功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes,KEGG)通路富集分析,利用Cytoscape软件构建"药材-化合物-靶点-通路-功效-疾病"网络,预测其可能的作用机制.结果 与对照组比较,模型组大鼠活动、饮食减少,足趾肿胀、关节呈急性炎症表现,关节炎评分显著增加(P＜0.01),血清中类风湿因子(rheumatoidfactor,RF)、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β 和 γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平均显著增加(P＜0.05、0.01、0.001),IL-10水平降低,脾脏、胸腺指数显著增加(P＜0.01、0.001),病理显示膝关节可见滑膜细胞增生、炎性细胞浸润,骨与软骨被侵蚀.与模型组比较,痹祺胶囊组大鼠踝关节病变情况得到不同程度改善,具体可见足肿胀度、关节炎评分显著降低(P＜0.05、0.01),血清中RF、IL-17、TNF-α、IL-1β、IFN-y水平显著降低(P＜0.05、0.01、0.001),IL-10水平增高,脾脏、胸腺指数降低(P＜0.05、0.01),踝关节骨、软骨组织损伤减轻,炎性细胞浸润、滑膜结缔组织增生减少.网络药理学预测发现,痹祺胶囊39个成分与RA交集靶点共371个.蛋白质-蛋白质相互作用网络分析结果显示,IL-6、白蛋白、TNF、血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶9、趋化因子配体8等124个靶点可能是痹祺胶囊治疗RA的关键靶点.KEGG通路富集分析获得IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、Th1和Th2细胞分化、VEGF信号通路、瞬时受体电位通道的炎症介质调节、Wnt信号通路、血小板激活等80条信号通路,与免疫调控、抗炎、抑制血管翳生成、成骨/破骨细胞平衡等过程相关.对网络进行分析发现痹祺胶囊治疗RA具有多成分、多靶点、多途径的特点,其中单体成分士的宁、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、异甘草素、迷迭香酸、阿魏酸等可能为痹祺胶囊的关键药效物质基础.结论 痹祺胶囊对Ⅱ型胶原诱导的RA大鼠模型治疗效果较好,可能通过抗炎、免疫调节、血管生成、骨形成/侵蚀平衡等发挥治疗作用,体现了痹祺胶囊治疗RA多成分、多靶点、多通路的特点.

近年来,国内网络药理学的研究成井喷之势,特别是聚焦在中药复方的网络药理学研究,这类研究大多是通过整合中药成分与靶点数据库的信息,从"成分-靶点-作用通路"的框架去预测中药复方治疗疾病的药效物质基础及作用机制.由于这类研究后续大多缺乏严谨的药理学实验验证,加上其研究对象仅限于特定方剂作用于特定疾病,导致其研究结论可信度较低,缺乏实际科学价值,研究结果与阐明中医理论的现代科学内涵相距甚远.笔者从事网络药理学研究多年,结合自己的研究方向,针对网络药理学未来发展趋势,提出以下两点个人的建议.(一)聚焦中医药理论的现代科学内涵阐释.中医通过辨证论治治疗疾病,比如清热解毒法是中医抗癌的重要法则,补肾法是中医抗老年痴呆的普遍治法.这意味着具有清热解毒、或具有补肾疗效的中药与复方,能够普遍地作用于西医肿瘤及老年痴呆.即清热解毒法、补肾法分别与西医肿瘤及阿尔茨海默病(AD)之间具有共同的生物学基础.而这些具体的生物学基础是什么,可以通过网络药理学的研究方法来预测与指导.笔者结合前期的网络药理学研究基础,提出基于网络距离法探讨补肾法调控内质网应激防治AD的科学假说,获得了国家自然基金面上资助(82074278).近期本团队从基于网络药理学方面预测了补肾方剂补肾益智方中两个天然产物蛇床子素及五味子醇甲B具有协同抗AD的作用,其作用机制与调控内质网应激相关,预测结果在APP/PS1转基因动物模型上得到了验证(Phyto-medicine,2023,已录用).笔者呼吁更多的网络药理学从业者能够聚焦于更具普适性的中医药理论防治疾病的现代科学内涵阐释,及其对中药发掘的指导价值研究.(二)拓展网络药理学应用领域,关注老药新用.国际上对网络药理学的关注一直是聚焦在药物重定位领域,但是基于网络药理学方法的药物重定位研究在国内并未引起足够的重视.笔者2020年受邀Med Res Rev杂志撰写了网络药理学方法在AD药物重定位方面的长篇综述,提出了整合网络药理学方法结合临床电子病历深度挖掘的老年痴呆药物发现框架,即通过网络药理学预测已上市药物潜在的抗老年痴呆活性,并基于大规模电子病历的队列回顾性研究验证预测药物与AD发病率之间的关系[Med Res Rev,2020,40(6):2386-2426].该研究框架已在多个研究案例中成功实现[Nat Aging,2021,1(12):1175-1188;Alzheimers Res Ther,2022,14(1):7].2022年,笔者整合了大规模的AD全基因组关联研究结果,进一步发展人工智能框架预测AD的风险基因,并基于这些潜在靶标开展AD药物重定位研究,网络距离法预测结合大规模电子病历回顾性队列分析发现抗2型糖尿病老药吡格列酮(pioglitazone)与AD疾病风险降低有关,网络分析结合体外人源小胶质细胞模型验证了吡格列酮的抗AD分子机制[Alzheimers Res Ther,2022,14(1):7].该研究思路通过进一步的学科交叉,将网络药理学的预测结果在大规模的临床数据中寻找证据,进一步提高了预测结果的可信度,也加速了药物的发现进程.