目的:研究胆道闭锁肝纤维化过程中Shh信号通路核转录因子Gli1/Gli2在肝上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)中的调控作用，为阐明胆道闭锁肝纤维化的机制提供依据。方法:选择2018年1月至2018年12月经手术证实为胆道闭锁Ⅲ型患儿的肝活检组织标本10例作为胆道闭锁组，年龄在1~3月龄。以相同年龄段无肝胆系统畸形死亡新生儿尸检肝组织5例作为正常对照组。应用实时荧光定量聚合酶链(RT-qPCR)反应及蛋白质印迹法检测肝组织中Gli1/Gli2、EMT关键调控因子Snail/Slug及EMT特征性细胞因子的表达。另将2周龄BALB/c小鼠处死后分离肝内胆管上皮细胞mIBEC，按处理方式不同分为正常对照组、干扰对照组、过表达对照组、Gli1-shRNA组、Gli1过表达组、Gli2-shRNA组、Gli2过表达组。其中，正常对照组加入等体积培养基，干扰对照组加入空白慢病毒，过表达对照组加入空白腺病毒，Gli1-shRNA组应用Gli1-shRNA沉默Gli1，Gli2-shRNA组应用Gli2-shRNA沉默Gli2，Gli1过表达组应用Gli1腺病毒过表达Gli1，Gli2过表达组应用Gli2腺病毒过表达Gli2。应用RNA干扰技术研究Shh信号通路关键转录因子Gli1/Gli2表达对EMT过程的调控作用。采用单因素方差分析和LSD- t检验对数据进行统计学分析。 结果:RT-qPCR检测结果显示，胆道闭锁组患儿肝组织Gli2、Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为10.96±6.21、7.37±4.09、8.85±2.37和7.35±4.09，较对照组肝组织4.46±1.24、3.34±0.95、4.49±2.07和3.38±0.93均明显升高，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。胆道闭锁组患儿肝组织E-cadherin相对表达量为3.00±1.29，较对照组4.96±1.91明显降低，组间差异亦有统计学意义( P<0.05)。应用RNA干扰技术沉默Gli2基因后，Gli2-shRNA组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为2.23±0.67、3.11±1.07和2.74±0.61，较干扰对照组5.21±0.88、3.67±1.04和3.46±1.24明显降低，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。Gli2-shRNA组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中E-cadherin mRNA相对表达量为9.09±1.29，较干扰对照组4.36±0.85表达明显升高，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。过表达Gli2基因后，Gli2过表达组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为9.89±2.06、14.51±3.63、12.41±3.00，较过表达对照组4.32±0.78、4.58±0.95、4.09±1.03明显升高，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。Gli2过表达组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中E-cadherin mRNA相对表达量为2.30±0.39，较过表达对照组6.09±1.40表达降低，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。沉默及过表达Gli1基因未见明确EMT特征细胞因子表达变化趋势。免疫荧光检测显示沉默Gli2基因表达后mIBEC中绿色荧光(胆管上皮细胞标记物CK19)增强，过表达Gli2基因后橙色荧光(间质细胞标记物α-SMA)增强。 结论:Shh信号通路在胆道闭锁肝纤维化中具有的重要作用，信号通路关键转录因子Gli2可显著调控肝内胆管上皮细胞EMT过程。

目的:探讨Hedgehog信号通路和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在胆道闭锁(biliary atresia, BA)肝纤维化进展中的作用，为BA肝纤维化发生机制提供实验依据。方法:选取2019年1月至2020年1月天津市儿童医院普外科12例BA患儿肝组织和4例先天性胆管扩张症(congenital biliary dilatation，CBD)患儿肝组织，通过免疫组织化学观察Hedgehog信号通路配体SHH、效应转录因子GLI2蛋白表达分布情况，并通过蛋白质印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测其蛋白及mRNA表达情况；通过免疫荧光染色观察EMT标记物神经钙粘蛋白(N-cadherin)及CK19表达分布情况。培养人肝内胆管上皮细胞，使用人重组SHH蛋白(r-SHH)和Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺(Cyclopamine)进行外源性干预后，检测Hedgehog信号通路激活水平、EMT标记物E钙黏素(E-cadherin)、N-cadherin蛋白及mRNA表达水平。结果:免疫组织化学实验结果显示，SHH表达于BA胆管上皮细胞胞质中，GLI2表达于BA胆管上皮细胞胞核中。蛋白印迹法实验结果显示，BA组SHH、GLI2蛋白相对表达量分别为2.09±0.43、1.94±0.17，CBD组SHH、GLI2蛋白相对表达量为1.00±0.05、1.00±0.37，组间比较，差异均有统计学意义( P均<0.05)。实时荧光定量聚合酶链反实验结果显示，BA组SHH、GLI2 mRNA的相对表达量分别为2.89±0.96、2.35±0.78，CBD组SHH、GLI2 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.34、1.00±0.22，组间比较，差异均有统计学意义( P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示，EMT标记物N-cadherin与CK19共表达于BA胆管上皮细胞。使用r-SHH处理激活Hedgehog信号通路效应转录因子GLI2后，促进了EMT(抑制了E-cadherin，增强了N-cadherin)，阻断该通路后，EMT被阻断。 结论:Hedgehog信号通路在BA中高表达，是促进肝内胆管上皮细胞发生EMT的重要诱导通路，其在BA肝纤维化进程中起重要作用，为BA肝纤维化发生机制提供实验依据。

目的:研究sonic hedgehog(Shh)信号通路核转录因子Gli1/Gli2在恒河猴轮状病毒(RRV)感染致胆道闭锁小鼠肝脏上皮间充质化(EMT)中的调控作用。方法:通过RRV构建胆道闭锁小鼠模型，根据RNA干扰技术对Shh信号通路关键转录因子Gli1/Gli2表达调控的不同，将实验小鼠分为正常组、模型组、Gli1过表达组、Gli1 shRNA组、Gli2过表达组、Gli2 shRNA组，应用实时荧光定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测实验小鼠肝脏组织中EMT关键调控因子Snail/Slug及EMT特征性细胞因子波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA及蛋白的表达；对不同分组中的小鼠肝脏组织分别行苏木精-伊红染色和Masson染色观察记录肝纤维组织表达面积百分比。采用单因素方差分析和 LSD- t检验进行数据分析。 结果:Gli2过表达组、Gli2 shRNA组及模型组Snail、Slug、Vimentin、α-SMA、E-cadherin mRNA相对表达量分别为15.13±3.40、5.48±0.46、8.78±1.06、12.40±2.18和3.06±0.53；3.73±1.16、5.62±1.75、3.56±1.06、3.88±1.16和10.51±1.83；8.13±1.27、5.32±0.98、5.05±0.98、4.02±0.77和5.12±1.60。与模型组相比，Gli2过表达组Snail、Vimentin、α-SMA的mRNA表达明显升高，E-cadherin的mRNA表达明显降低，差异均有统计学意义( t＝4.53、5.29、8.12、-2.13，均 P<0.05)；与模型组相比，Gli2 shRNA组Snail、Vimentin的mRNA表达明显降低，E-cadherin的mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义( t＝-2.86、-2.12、5.62，均 P<0.05)。Gli2过表达组、Gli2 shRNA组及模型组Snail、Slug、Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白灰度比值分别为2.02±0.39、0.31±0.08、0.95±0.17、1.07±0.17和0.42±0.06；0.53±0.13、0.40±0.18、0.20±0.04、0.28±0.07和1.09±0.31；0.70±0.15、0.42±0.22、0.64±0.13、0.81±0.11和0.42±0.09。与模型组相比，Gli2过表达组Snail、Vimentin、α-SMA蛋白灰度比值明显升高，差异均有统计学意义( t＝12.71、4.28、3.70，均 P<0.05)；与模型组相比，Gli2 shRNA组Vimentin、α-SMA表达明显降低，E-cadherin表达明显升高，差异均有统计学意义( t＝-6.14、-7.57、5.96，均 P<0.05)。Gli1过表达组及Gli1 shRNA组小鼠肝脏组织未见明确EMT特征细胞因子表达变化趋势。正常组、模型组、Gli1过表达组、Gli1 shRNA组、Gli2过表达组、Gli2 shRNA组肝脏纤维组织表达面积百分比分别为(1.03±0.58)%、(33.02±11.39)%、(39.81±5.67)%、(26.06±1.29)%、(49.81±8.57)%和(17.55±0.66)%。Gli2过表达组及Gli2 shRNA组与模型组肝脏纤维组织表达面积百分比相比，差异均有统计学意义( t＝3.21、-2.96，均 P<0.05)；Gli1过表达组及Gli1 shRNA组与模型组肝脏纤维组织表达面积百分比相比，差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:Shh信号通路在胆道闭锁小鼠肝纤维化中起重要作用，Shh信号通路关键转录因子Gli2可显著调控胆道闭锁小鼠肝脏EMT过程。

目的:观察胶质瘤相关癌基因1特异性阻断剂(GANT-61)对结直肠癌肿瘤干细胞(CRC-CSCs)分化及对Hedgehog信号通路的调控作用的影响。方法:磁珠分选法获得CD133 ＋ CRC-CSCs，用含不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的GANT-61的干细胞培养液干预，设为对照组、低、中、高剂量组，测定干预不同时刻细胞活性、CRC-CSCs球形成率、CD133 ＋占比、核转录因子1(Gli1)、Hh受体蛋白(Ptch1)、c-Myc、细胞角蛋白20(CK20) mRNA和蛋白表达。多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK- q检验。 结果:与对照组比较，GANT-61各剂量组不同时刻CCK-8试验吸光度( A)值均降低(24 h： t＝2.445、4.985、6.903；48 h： t＝2.859、5.270、7.488；72 h： t＝3.324、8.053、12.042， P<0.05)，且随GANT-61干预剂量升高而降低( F＝13.382、16.842、41.053， P<0.05)，差异有统计学意义；对照组、低、中剂量组CCK-8试验 A值随干预时间延长升高，且干预不同时刻CCK-8试验 A值比较差异均有统计学意义( F＝44.598、31.844， P<0.05)，而高剂量组随干预时间延长无明显变化( F＝1.585， P>0.05)，差异无统计学意义。对照组、GANT-61低、中、高剂量组CRC-CSCs球形成率分别为(13.57±1.55)%、(11.22±1.01)%、(5.46±0.67)%、(1.60±0.30)%，CD133 ＋占比分别为(96.20±3.07)%、(81.34±5.84)%、(62.01±5.03)%、(45.38±4.21)%；与对照组比较，GANT-61各剂量组CRC-CSCs球形成率及CD133 ＋占比均降低(CRC-CSCs球形成率： t＝2.840、10.739、16.954， P<0.05；CD133 ＋占比： t＝5.036、12.974、21.809， P<0.05)，且随GANT-61干预剂量升高而降低，各剂量组组间比较差异均有统计学意义(CRC-CSCs球形成率： F＝225.500， P<0.05；CD133 ＋占比： F＝62.988， P<0.05)。与对照组比较，GANT-61各剂量组Gli1、Ptch1、c-Myc、CK20 mRNA和蛋白相对表达量均降低(mRNA：低剂量组 t＝2.577、2.659、2.524、4.031；中剂量组 t＝5.271、5.587、6.163、6.500；高剂量组 t＝7.442、8.976、8.750、9.632， P<0.05；蛋白：低剂量组 t＝3.008、2.517、2.385、2.981；中剂量组 t＝5.664、8.923、9.500、11.180；高剂量组 t＝14.435、14.137、15.727、14.142， P<0.05)，且随GANT-61干预剂量升高而降低(mRNA： F＝14.825、21.057、22.389、27.160， P<0.05；蛋白： F＝65.340、95.789、151.230、119.877， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:GANT-61可能通过下调Hedgehog信号通路基因Gli1、Ptch1、靶基因c-Myc、分化基因CK20 mRNA和蛋白的表达，从而起到抑制CRC-CSCs细胞自我更新能力、促进细胞分化作用。

目的:探究miR-130a-5p靶向Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)对牙槽骨成骨细胞(Alveolar osteoblast,AOB)增殖、凋亡、成骨分化的影响及其机制.方法:将AOB分为NC组、miR-NC组、miR-130a-5p组、miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组.双荧光素酶报告验证miR-130a-5p对Runx2、Sonic hedgehog(SHH)的调控关系;CCK-8及EdU染色检测细胞增殖能力;AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡能力;ALP染色、茜素红染色检测细胞成骨分化能力;RT-qPCR检测miR-130a-5p、Runx2、SHH、神经胶质瘤关联癌基因同源物1(Gli1)mRNA水平;Western Blot检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 related X protein,Bax)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)、Runx2、SHH、Gil1水平.结果:miR-130a-5p靶向调控Runx2、SHH.过表达miR-130a-5p后,细胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU阳性率降低,细胞凋亡率升高,成骨分化能力降低,miR-130a-5p、Bax蛋白水平升高,Runx2、PCNA、Ki67、Bcl-2、ALP、OCN、BMP2蛋白及SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平均降低(P＜0.05).过表达miR-130a-5p和Runx2或过表达miR-130a-5p和SHH可减弱过表达miR-130a-5p对细胞增殖、凋亡、成骨分化的影响.结论:miR-130a-5p靶向Runx2抑制AOB增殖和成骨分化,并促进AOB凋亡,其可能通过抑制SHH信号通路发挥作用.

目的 比较幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与非Hp感染的慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)患者胃黏膜病理状态与刺猬蛋白-细胞表面受体Ptch-G蛋白偶联受体样蛋白Smo-胶质瘤相关癌基因同源蛋白Gli(Hedgehog信号通路,Hh-Ptch-Smo-Gli)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶/核因子κB/转录信号转导子和转录活化子1(NOX/NF-κB/STAT1)信号通路相关因子表达差异,探究Hp促进CAG"炎癌转化"的生物学机制.方法 纳入符合标准的43名CAG患者,分为CAG伴Hp感染组(Hp+CAG组,n=21)、CAG不伴Hp感染组(Hp-CAG组,n=22),观察两组患者胃黏膜苏木精-伊红(HE)染色组织形态学改变,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测胃黏膜NOX1、NOX2、NOX4、STAT1、P65、p-P65相对表达量;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测胃黏膜胶质瘤相关癌基因同源蛋白1 mRNA(Gli1 mRNA)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白2 mRNA(Gli2 mRNA)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白3 mRNA(Gli3 mRNA)、音猬因子mRNA(Shh mRNA)、G蛋白偶联受体样蛋白mRNA(Smo mRNA)、细胞表面受体Ptch mRNA(Ptch mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1 mRNA(NOX1 mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 mRNA(NOX2 mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 mRNA(NOX4 mRNA)、核因子κB mRNA(NF-κB mRNA)水平.结果 两组患者胃组织HE染色结果:Hp+CAG组患者胃黏膜上皮细胞部分坏死脱落,表面欠光整,腺体数量减少,排列紊乱,可见肠上皮化生,固有层内可见弥漫性淋巴细胞、中性粒细胞浸润;Hp-CAG组患者淋巴细胞和中性粒细胞浸润程度较Hp+CAG组轻.RT-qPCR检测结果:与Hp-CAG组相比,Hp+ CAG组患者胃黏膜Gli1 mRNA、Shh mRNA、Smo mRNA、Ptch mRNA水平显著降低(P<0.01);Gli2 mRNA、Gli3 mRNA、NOX1 mRNA、NOX2 mRNA、NOX4 mRNA、NF-κB mRNA水平显著增高(P<0.01).Western blot检测结果:与Hp-CAG组相比,Hp+CAG组患者胃黏膜NOX1/GAPDH(内参)、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH、p-P65/GAPDH相对表达量明显增高(P<0.01),STAT1水平显著降低(P<0.01),两组P65/GAPDH相对表达量的差异没有统计学意义(P>0.05).结论 Hp感染后可能通过抑制Hh-Ptch-Smo-Gli信号通路,并使NOX/NF-κB/STAT1信号通路异常活化,导致胃黏膜长期炎症,促进萎缩及肠上皮化生,增加癌变风险.

目的:探讨生理性拉应力对软骨细胞分化的调控作用,并阐明其相关信号通路机制.方法:体外培养软骨ATDC5细胞,应用四点弯曲细胞力学加载仪对其施加生理性拉应力,首先分为对照组和拉应力组(2 000 μstrain/2 h组),另分为不同力值(1 000、2 000和3 000 μstrain)加力时间为2 h和力值为2 000 μstrain不同加力时间(1、2和4 h)组,同时设未加力的细胞为对照组,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、Ⅹ型胶原(Col-Ⅹ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、血管内皮生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Nel样1型分子(Nell-1)、Runt相关转录因子2(Runx2)、印度刺猬因子(Ihh)、补缀同源物1(Ptch-1)、GLI家族锌指蛋白1(Gli-1)和刺猬因子相互作用蛋白1(Hhip-1)mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中Nell-1、Runx2和Ihh蛋白表达水平.ATDC5细胞分为对照组、环巴胺组、拉应力组和环巴胺+拉应力组,采用 RT-qPCR法检测各组细胞中 Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中 Nell-1和Ihh蛋白表达水平.结果:与对照组比较,2 000 μstrain/2 h组细胞中Col-Ⅱ、Col-Ⅹ、Aggrecan、SOX9、VEGF和PCNA mRNA表达水平均明显升高(P<0.01).在对细胞施加2 000 μstrain不同加力时间(1、2和4 h)或不同力值(1 000、2 000和3 000 μstrain)2 h的拉应力后,与对照组比较,随时间的延长或力值的增加其他各组细胞中Runx2 mRNA表达水平逐渐升高(P<0.01),Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1 和Hhip-1 mRNA表达水平逐渐升高(P<0.01),且在2 000 μstrain/2 h时达到最高,随后出现回落但仍明显高于对照组(P<0.01).Western blotting检测,各组细胞中Nell-1、Runx2和Ihh蛋白表达水平与mRNA表达水平变化趋势一致.环巴胺预处理后,与对照组比较,环巴胺组细胞中Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平均明显降低(P<0.01),拉应力组和环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与环巴胺组比较,环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与拉应力组比较,环巴胺+拉应力组细胞中Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01).与对照组比较,环巴胺组细胞中Ihh蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Nell-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),拉应力组和环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1 和Ihh蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与环巴胺组比较,拉应力组和环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1和Ihh蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与拉应力组比较,环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1和Ihh蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05).结论:在生理性拉应力刺激下,Nell-1可在上游激活Ihh信号通路,进而调控ATDC5软骨细胞的分化.

目的:探讨积雪草酸对大鼠绝经后骨质疏松症(OP)的治疗作用及相关机制.方法:采用一次性手术摘除双侧卵巢方式构建绝经后 OP大鼠模型,分为模型组(9 只)、雌二醇组(10 只)、积雪草酸低剂量组(10 只)、积雪草酸中剂量组(10 只)和积雪草酸高剂量组(10 只).另取 9 只大鼠作为假手术组.观察骨组织病理改变、骨密度及微结构,以及血清骨代谢指标、骨代谢相关基因及蛋白表达.结果:雌二醇组和积雪草酸低、中、高剂量组均可减轻骨组织病理改变,增加骨密度,改善骨微结构.与假手术组比较,模型组大鼠股骨骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)下降,结构模式指数(SMI)和骨小梁分离度(Tb.Sp)上升,血清骨碱性磷酸酶(BALP)水平下降,Ⅰ型胶原交联氨基端肽(NTX-Ⅰ)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)水平上升,骨组织音猬因子(SH H)、细胞表面跨膜蛋白Patched1(Ptc1)、7 次跨膜蛋白(Smo)、Gli家族锌指蛋白-1(Gli1)、矮小相关转录因子2(Runx2)、骨保护素(OPG)、成骨细胞特异性转录因子(Osx)mRNA 和蛋白表达下降,细胞核因子-κB受体活化因子(RANKL)mRNA和蛋白表达上升(均P<0.05).与模型组比较,雌二醇组和积雪草酸低、中、高剂量组大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th上升,SMI和Tb.Sp下降,血清BALP水平上升,NTX-Ⅰ和TRAP水平下降,骨组织 SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx mRNA 和蛋白表达上升,RANKL mRNA 和蛋白表达下降(均 P<0.05).雌二醇组和积雪草酸低剂量组上述指标比较差异无统计学意义(均P>0.05).积雪草酸低、中、高剂量组上述指标呈剂量依赖性(均P<0.05).结论:积雪草酸可治疗绝经后 OP,可能与激活 Hedgehog信号通路相关.

目的 探讨小分子药物嘌吗啡胺(PM)靶向激活Hedgehog(Hh)信号通路后对骨髓来源间充质干细胞(BM-SCs)成骨-成脂分化平衡的影响及其机制.方法 通过细胞计数试剂盒-8法评估PM对BMSCs增殖的细胞毒性,并通过检测不同浓度PM处理下BMSCs细胞内Gli1转录水平,选择合适的PM处理浓度.随后通过诱导BMSCs成骨、成脂分化,检测ALP表达(ALP染色)、钙结节(Von Kossa矿化结节染色法)评估PM对BMSCs成骨诱导的影响,采用油红O染色检测PM对BMSCs成脂诱导的影响.最后通过qRT-PCR法验证PM干预下BMSCs成骨-成脂分化过程中相关核心转录因子、特征基因的变化.结果 10 μmol/L及以下浓度的PM对BMSCs增殖无明显毒性反应,并且2 μmol/L PM即可显著激活BMSCs细胞内Hh信号通路(P＜0.01).在2 μmol/LPM干预下,BMSCs成骨分化诱导时ALP表达、钙结节形成较对照组显著增强,而成脂分化诱导时脂滴的形成受到了明显的抑制.在此基础之上,qRT-PCR结果提示2 μmol/L PM可明显促进BMSCs成骨分化过程中核心转录因子Sp7以及特征性基因ALP、整合素结合唾液酸蛋白(lbsp)的转录,并抑制成脂分化过程中核心转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Pparg)、CCAAT增强子结合蛋白α(Cebpa)以及特征基因围脂滴蛋白1(Plin1)、脂联素(Adipoq)、脂肪酸转位酶(Cd36)的转录.结论 PM可通过激活Hh信号通路,调控成骨-成脂分化相关核心转录因子,促进BMSCs成骨分化并抑制其成脂分化.

目的 观察抑制核转录因子Gli1表达对人肺腺癌耐顺铂细胞株的顺铂耐药性逆转作用.方法 将人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP随机分为GANT61 组、环杷明组、LY294002 组、对照组,其中GANT61 组加入10 μmol/L的Gli1抑制剂GANT61,环杷明组加入10 μmol/L的Smo抑制剂环杷明,LY294002组加入20 μmol/L的PI3K抑制剂LY294002,对照组加入培养基.各组细胞继续培养48 h后,采用实时荧光定量PCR法和Western Bolt-ting法检测细胞中Gli1 mRNA和蛋白,采用MTT法测算顺铂对各组细胞的半数抑制浓度(IC50),采用Western Boltting法检测细胞中多药耐药相关蛋白(MRP1)及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,采用Annexin V-FITC法测算各组细胞凋亡率.结果 GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Gli1 mRNA相对表达量分别为0.30±0.08、0.62±0.12、0.68±0.11、1.05±0.10,其中环杷明组与LY294002组相比,P>0.05;其余组间两两相比,P均<0.05.GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Gli1蛋白相对表达量分别为0.28±0.12、0.59±0.07、0.55±0.13、0.97±0.06,其中环杷明组与LY294002组相比,P>0.05;其余组间两两相比,P均<0.05.顺铂对GANT61组、环杷明组、LY294002 组、对照组细胞的 IC50 值分别为(7.35±1.03)、(9.86±0.71)、(10.23±1.02)、(14.26±2.10)μg/mL,其中环杷明组与LY294002组相比,P>0.05;其余组间两两相比,P均<0.05.GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组MRP1蛋白的相对表达量分别为0.18±0.09、0.38±0.17、0.58±0.19、0.83±0.24,组间相比,P均<0.05.GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞凋亡率分别为27.27%±0.99%、15.45%±1.01%、12.35%±1.80%、6.25%±0.38%,其中环杷明组与LY294002组相比,P>0.05;其余组间两两相比,P均<0.05.GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Bcl-2蛋白的相对表达量分别为0.15±0.08、0.33±0.15、0.63±0.13、0.91±0.19,组间相比,P均<0.05.GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Bax蛋白的相对表达量分别为1.88±0.38、1.34±0.25、1.27±0.39、0.64±0.18,其中环杷明组与LY294002组相比,P>0.05;其余组间两两相比,P均<0.05.结论 抑制Gli1表达可通过降低顺铂对A549/DDP细胞的IC50、促进A549/DDP细胞凋亡,逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性;Smo抑制剂环杷明、PI3K抑制剂LY294002、Gli1抑制剂GANT61均可抑制A549/DDP细胞中Gli1的表达.