本研究采用高通量血清代谢组学及网络药理学技术探究二至丸对阿尔茨海默病的药效机制.将60只雄性SD大鼠按体重随机分6组,每组10只,即为假手术组、模型组、阳性药组、低剂量组、中剂量组和高剂量组.模型组和各给药组大鼠给与D-半乳糖腹腔注射和双侧脑室注射β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)建立阿尔茨海默病大鼠模型,模型制备第6周后,给药组每天给与相应药物进行干预,其他组给与相同体积生理盐水(4周),采用Morris水迷宫实验观测各组大鼠空间学习记忆能力,采用Western blotting检测大鼠海马tau蛋白表达.利用高通量血清代谢组学技术结合模式识别方法寻找内源性差异代谢物及相关代谢通路;采用网络药理学技术探究二至丸的潜在活性成分、关键靶点,进一步将代谢组学与网络药理学技术整合聚焦关键靶标及成分,最终采用分子生物学技术靶向验证.通过水迷宫实验及大鼠海马tau蛋白程度,证明模型制备成功.代谢组学结果显示模型组与假手术组代谢轮廓发生明显分离,给药组处于假手术组和模型组间,证明模型组大鼠的整体代谢发生显著变化,给与二至丸后呈现回调趋势.代谢组学结果发现16个生物标记物,主要涉及10个代谢通路.网络药理学结果显示二至丸内主要有β-谷甾醇、山柰酚、紫杉醇等13个潜在有效成分、与阿尔茨海默病相关的直接作用靶标有毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1等11个蛋白成分.基于以上可知,二至丸对阿尔茨海默病大鼠有很好的干预作用,其可能通过槲皮素对组织蛋白酶D直接调控作用达到干预疾病的目的.

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以中央气道黏液分泌增加,小气道壁损伤和修复反复发生导致气道重塑,引起固定性气道阻塞及不可逆性肺泡结构丧失为主要的病理特征〔1〕.毒蕈碱样胆碱能受体(mAchR,简称M受体)是气道中主要的副交感神经递质,通过胆碱能神经释放的乙酰胆碱(Ach)调节气道平滑肌张力和黏液的分泌,是COPD 患者气道最主要的可逆性成分.M受体在改善哮喘和COPD等呼吸系统疾病的气道炎症和气道重塑方面具有重要作用〔2〕.本文综述总结近年来关于M受体在COPD中的作用.

急性有机磷杀虫药中毒是我国最常见的农药中毒,一般在农村较多见.其发病时间与有机磷杀虫药中毒途径、种类、剂量有关.口服途径中毒者较常见,口服中毒着通常10 min至2 h内发病,吸入者30 min发病,皮肤吸收者2~6 h发病.有机磷杀虫药中毒表现多样化,轻度以毒蕈碱样(M 样)症状为主,中度表现为M 样和烟碱样(N样)症状,重度同时表现 M 样、N 样症状和中枢神经系统症状.抗胆碱药硫酸阿托品一直以来是治疗急性有机磷杀虫药中毒最主要的、经典的药物,对M 样中毒症状有较好、较快的对抗作用.但是治疗急性有机磷杀虫药中毒时硫酸阿托品一般用量大,治疗剂量接近中毒剂量,所以硫酸阿托品中毒是造成有机磷杀虫药中毒患者死亡的重要因素之一[1].由解放军军事医学科学院研制的新型抗胆碱药盐酸戊乙奎醚能拮抗中枢和外周 M、N 样受体,具有半衰期长等优点,现在广泛应用于临床.我科早期应用硫酸阿托品联合盐酸戊乙奎醚治疗急性有机磷杀虫药中毒取得了良好的效果,现报告如下.

目的 阐明东莨菪碱发挥抗抑郁作用的可能脑区和靶点.方法 明确东莨菪碱的抗抑郁样作用:将正常SpragueDawley(SD)大鼠采用数字表法随机分为东莨菪碱组和0.9％(质量分数)氯化钠注射液对照组,腹腔注射25 μg/kg东莨菪碱或等体积0.9％(质量分数)氯化钠注射液,24 h后进行旷场实验和强迫游泳实验以评价东莨菪碱对大鼠抑郁样行为的影响;明确东莨菪碱发挥抗抑郁效应的脑区:在腹腔注射25 μg/kg东莨菪碱前1h向大鼠内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)立体定位注射γ-氨基丁酸-A(γ-aminobutyric acid-A,GABA-A)受体激动剂蝇蕈醇(Muscimol) 1.25 μg,24 h后观察东莨菪碱的行为学效应是否被阻断;探索东莨菪碱抗抑郁的作用靶点:通过微量给药系统分批次分别向大鼠侧脑室注射毒蕈碱型乙酰胆碱受体2(muscarinic acetylcholine receptor 2,M2)选择性拮抗剂(methoctramine,MCT)0.5、1和2μg,对照组均给予2μL 0.9％(质量分数)氯化钠注射液,24 h后利用旷场实验和强迫游泳测试评价大鼠行为学变化.结果 腹腔注射东莨菪碱24 h后,大鼠强迫游泳不动时间低于对照组(P＜0.05),旷场总路程差异无统计学意义(P＞0.05);向mPFC注射Muscimol可明显增加东莨菪碱组大鼠的不动时间(P＜0.01),旷场总路程差异无统计学意义(P＞0.05);与侧脑室注射0.9％(质量分数)氯化钠注射液相比,0.5μg MCT不影响大鼠在强迫游泳实验中不动时间(P＞0.05),1μg MCT可明显降低影响大鼠不动时间(P＜0.01),而2μg MCT则可明显增加影响大鼠不动时间(P＜0.05).结论 东莨菪碱可能通过阻断mPFC的M2受体发挥抗抑郁作用.

目的 探讨不同浓度乙酰胆碱对骨骼肌干细胞增殖和分化的影响及可能的机制.方法 培养小鼠骨骼肌干细胞C2C12细胞.①采用实时定量PCR法及Western blotting法检测C2C12细胞毒蕈碱样乙酰胆碱受体M1～M5亚型表达情况.②将C2C12细胞分为对照组、乙酰胆碱1组、乙酰胆碱2组、乙酰胆碱3组、乙酰胆碱4组,分别加入乙酰胆碱0、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L,分别培养24、48、72 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况,采用实时定量PCR法检测细胞增殖标志基因Pax7 mRNA表达.③取用诱导分化1d后的C2C12细胞,分为对照2组、乙酰胆碱5组、乙酰胆碱6组、乙酰胆碱7组、乙酰胆碱8组,分别加入乙酰胆碱0、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L,培养5d,采用光学显微镜观察法观察各组肌管的形成情况,采用实时定量PCR法检测细胞分化相关基因生肌调节因子(MyoD)、肌细胞生成蛋白(MyoG)、生肌调节因子(MYf5) mRNA表达.结果 ①M2受体mRNA及蛋白表达均为最高,M3受体mRNA及蛋白表达均为最低(P均＜0.05).②与对照组比较,乙酰胆碱1～4组各时点细胞增殖及Pax7 mRNA表达差异均无统计学意义(P均＞0.05).③光镜下发现,与对照2组相比,乙酰胆碱5组C2C12细胞分化明显,且肌管数目略有增多;乙酰胆碱6～8组C2C12细胞分化被抑制,以乙酰胆碱8组分化为成熟肌管数目减少最明显.乙酰胆碱5、6组MyoG mRNA表达均高于对照2组(P均＜0.05).乙酰胆碱7、8组MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表达均低于对照2组,且乙酰胆碱8组MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表达均低于乙酰胆碱7组(P均＜0.05).结论 高浓度乙酰胆碱可抑制C2C12细胞分化及其肌管形成,其机制可能与抑制分化相关基因MyoG、MyoD、Myf5的表达有关.

目的 观察梓醇对阿尔茨海默病(AD)大鼠模型大脑皮质的保护作用.方法 健康雄性Wistar大鼠36只,体质量范围为250～300 g,随机数字表法分为4组,每组9只:健康对照组、模型组、梓醇小剂量组、梓醇大剂量组.除健康对照组大鼠外,其余组大鼠均行右侧脑室定位注射β-淀粉样蛋白片段25-35(Aβ25-35)和腹腔注射D-半乳糖结合制备AD模型,然后梓醇小剂量组大鼠注射梓醇5 mg·kg-1·d-1,梓醇大剂量组大鼠注射梓醇10 mg·kg-1·d-1,健康对照组和模型组大鼠注射等容积0.9％氯化钠水溶液,连续腹腔注射给药7 d.Y-迷宫检测大鼠的学习指数,苏木精-伊红(HE)染色和透射电镜观察AD大鼠皮层结构,免疫组织化学染色观察大脑皮质胆碱能毒蕈碱受体M1亚型(M1受体)的表达,蛋白质印迹法(Western Blot)检测M1受体蛋白的含量.结果 实验过程中模型组大鼠死亡1只,最终模型组n=8,其余组均n=9.与模型组比较,从造模后第14天开始,梓醇显著提高了大鼠的学习指数(第14天:小剂量组t=3.267,P=0.0309,大剂量组t=4.648,P=0.0097;第21天:小剂量组t=5.010,P=0.0074,大剂量组t=4.614,P=0.0099),第14天4组大鼠的学习指数分别为(5.6±0.2),(2.6±0.3),(3.7±0.5),(4.4±0.6);第21天4组大鼠的学习指数各组分别为(6.3±0.8),(4.1±0.5),(5.3±0.4),(5.8±0.8).HE染色可见模型组大鼠大脑皮质结构有损伤性表现,透射电镜检查见大脑皮质神经元细胞内线粒体、粗面内质网、核染色质等异常改变,梓醇干预组神经元的结构显著改善.免疫组织化学染色可见模型组大鼠大脑皮质M1受体染色浅,神经元数目减少,M1受体蛋白表达下调,梓醇能够显著上调M1受体蛋白表达(与模型组比较,小剂量组t=3.983,P=0.0164;大剂量组t=6.694,P=0.0026),4组大鼠M1受体蛋白表达分别为100％,64.75％,74.63％,85.74％.结论 梓醇能够改善AD大鼠大脑皮质结构异常,升高M1受体表达.

随着近视患病率以及高度近视患病率的逐年上升,青少年近视防控方法倍受关注.阿托品作为较早用于控制近视的药物,其临床效果已在循证医学方法中得到肯定,但是其作用机制不明.研究发现,阿托品抑制实验性近视进展的作用部位可能并不与睫状肌调节相关,或睫状肌并非主要作用靶点.目前阿托品近视控制机制的研究多关注在视网膜和巩膜.近年来应用高选择性毒蕈碱样(M)受体拮抗剂及其他药物的联合应用发现,阿托品控制近视进展可能与多个M受体相关,同时与多巴胺分泌、γ-氨基丁酸能通路蛋白改变、一氧化氮(N0)生成、早期生长反应(EGR)-1表达、巩膜蛋白改变等相关.本文就阿托品在实验性近视眼中发挥控制近视作用的作用部位,与胆碱能通路、多巴胺能通路、γ-氨基丁酸能通路、NO分泌、EGR-1表达、巩膜重塑过程等的关系进行综述,并对阿托品控制近视作用的研究进行展望.

目的 筛查肥厚型心肌病相关的关键基因,为肥厚型心肌病的发病机制提供理论依据.方法 从高通量基因表达(GEO)数据库中检索包含106例肥厚型心肌病样本及39例对照组样本的高通量测序数据集GSE36961.利用R软件筛选肥厚型心肌病组织和正常组织间差异表达的基因,通过WGCNA构建差异基因的加权重共表达网络,筛选出与肥厚型心肌病相关的模块,对模块中的基因行功能富集分析,并应用STRING数据库构建蛋白互作网络筛选出关键基因.结果 从数据集中筛选出8 002个差异表达基因(P＜0.05),通过WGCNA构建出差异基因的加权重共表达网络,筛选出两个与肥厚型心肌病相关的模块:青色模块(Pearsoncor=0.77,P=4e-29)和紫红色模块(Pearson cor=0.76,P=2e-28).前者基因功能主要富集在能量代谢,后者基因功能主要富集在血管形成.通过蛋白质相互作用网络分析获得32个基因及157个互作关系,从中筛选出与肥厚型心肌病相关的关键基因,提示肥厚型心肌病可能与炎症反应相关.结论 本研究通过系统性分析肥厚型心肌病患者的高通量测序数据集,筛选出可能与肥厚型心肌病有关的目标基因32个,再筛选出关键基因10个,其中甲酰肽受体2(formyl peptide receptor 2,FPR2)、毒蕈碱型胆碱受体M2(cholinergic receptor muscarinic 2,CHRM2)与心肌炎症反应相关,余基因的作用仍需在未来的细胞及动物实验中得到进一步的验证.

炎症与免疫功能紊乱是脓毒症致死、致残的根本原因,近年来研究发现,胆碱能系统能实时、动态地调控脓毒症的炎症与免疫,一方面迷走神经借助胆碱能抗炎通路(CAP)和α7-烟碱样乙酰胆碱受体(nAChRs)而感知和调节局部或全身炎症;另一方面脑内乙酰胆碱作用于前脑胆碱能神经元毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型M1(M-AchRM1),通过影响延髓内脏带(MVZ)而间接调控炎症与免疫.笔者分析既往文献发现,MVZ是神经系统调控炎症与免疫的初级中枢与中心环节,是协调交感与迷走神经系统、神经与神经-内分泌系统对炎症与免疫调控的关键枢纽;α 7-nAChRs广泛表达于免疫细胞、神经元和肌细胞中,能调控局部组织炎症和系统性炎症,并能反映组织急/慢性炎症状态;M-AchRM1主要在高级神经中枢中表达并调控系统性炎症;脓毒症可诱导MVZ、下丘脑及前脑的神经炎症,导致其调控紊乱,这可能是脓毒症炎症与免疫紊乱的根本机制,故着力于α7-nAChRs和M-AchRM1的调控可能成为未来脓毒症诊疗的重要策略.

背景 肝细胞癌(HCC)是一种恶性程度较高的癌症.甲胎蛋白(AFP)是临床常用的HCC诊断标志物,但其灵敏度仅为41％～65％,漏诊率较高,因此亟须寻找新的诊断标志物和诊断方法以提升AFP阴性患者等的HCC检出率.目的 评估毒蕈碱乙酰胆碱受体m3自身抗体(m3AchR-Ab)对AFP阴性HCC患者的诊断效能,并探索m3AchR-Ab对HCC患者的诊断价值.方法 选取2011年11月至2015年9月入库于新疆医科大学第一附属医院标本库的257例患者血清样本,其中90例已确诊为HCC患者的血清样本为HCC组,89例已确诊为良性肝病(肝硬化及肝血管瘤等肝病)患者的血清样本为良性肝病组,78例健康受试者的血清样本为对照组.使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测并比较3组血清m3AchR-Ab水平,分析血清m3AchR-Ab水平与HCC患者性别、年龄、HCC肿瘤大小(最大直径)和数量、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、乙肝表面抗原(HBsAg)的关系,采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清m3AchR-Ab水平对AFP阴性HCC的诊断价值.结果 HCC组血清m3AchR-Ab水平高于良性肝病组和对照组血清(P<0.05).m3AchR-Ab水平与HCC肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和HBsAg相关(P<0.05).血清m3AchR-Ab水平诊断AFP阴性HCC的ROC曲线下面积为0.69〔95％CI(0.54,0.83)〕,最佳截断值为74.00 ng/ml,灵敏度为64.00％,特异度为91.02％.血清m3AchR-Ab联合AFP水平诊断HCC的ROC曲线下面积为0.90〔95％CI(0.85,0.95)〕,灵敏度为90.00％,特异度为88.02％.结论 血清m3AchR-Ab水平对AFP阴性HCC具有一定的诊断价值,且使用m3AchR-Ab和AFP联合诊断可提高HCC诊断效能,这可为未来研究新型HCC诊断标志物提供更多参考.