目的:探讨睡眠剥夺状态下健康志愿者脑葡萄糖代谢和血流灌注的改变以及二者之间的关系，揭示睡眠剥夺后脑功能损伤的具体脑区定位。方法:前瞻性选取2019年1月至2019年12月间郑州大学人民医院的17名健康志愿者[男8名、女9名，年龄(22.5±1.7)岁]，对志愿者进行2次磁共振三维(3D)动脉自旋标记(ASL)及 18F-FDG PET/CT显像，第1次在正常睡眠后2 h，第2次在睡眠剥夺24 h后。应用统计参数图(SPM)软件对3D-ASL图像和 18F-FDG PET/CT图像处理，分别得到睡眠剥夺前后脑代谢及灌注差异激活图，再获得代谢及灌注差异共同激活脑区图。将异常激活的脑区设为ROI，获得其脑血流量(CBF)值及SUV比(SUVR)值(以小脑为参考区)，采用配对 t检验及Pearson相关分析对数据进行处理。 结果:受试者睡眠剥夺后脑代谢与脑灌注均减低，且异常脑区相似，脑代谢减低的脑区明显多于灌注减低的脑区；睡眠剥夺后代谢及灌注共同减低的脑区集中于额叶、颞叶、顶叶等脑区；睡眠剥夺后受试者左侧背外侧额上回CBF值及SUVR值有相关性( r＝0.58， P＝0.014)。受试者睡眠剥夺后全脑平均CBF值[(46.32±7.39) ml·100 g -1·min -1]及SUVR值(1.46±0.04)均低于睡眠剥夺前全脑平均CBF值[(54.91±6.51) ml·100 g -1·min -1]及SUVR值(1.53±0.06)，差异均有统计学意义( t值：-2.67、-3.72， P值：0.012、0.001)。 结论:初步揭示了睡眠剥夺后受试者脑功能损伤的具体脑区定位。对于睡眠剥夺脑功能研究， 18F-FDG PET/CT与3D-ASL具有一致性且前者更为敏感。左侧背外侧额上回可能是睡眠剥夺后脑功能损伤的核心脑区。

目的:探讨缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)脑血管内皮细胞bEnd.3分泌的外泌体(exosome, Exo)对氧葡萄糖剥夺(oxygen and glucose deprivation, OGD)神经元的影响。方法:将bEnd.3暴露于OGD 3 h模拟体内IPC，复氧48 h后提取条件培养液中的外泌体(IPC Exo)，采用蛋白质印迹分析和透射电镜方法进行鉴定Exo。将IPC Exo与原代培养的小鼠大脑皮质神经元共同孵育24 h，共聚焦显微镜观察Exo能否被原代培养的小鼠大脑皮质神经元摄取。将原代培养的小鼠大脑皮质神经元分为对照组、OGD组、OGD＋IPC Exo(5μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml)组以及Sham OGD组(常氧条件培养的bEnd.3分泌的Exo进行处理)，采用CCK-8和细胞存活/死亡检测试剂盒检测细胞活力。结果:透射电镜观察显示，bEnd.3培养液提取物呈现Exo典型形态，即直径30～100 nm的双凹圆盘状囊泡。蛋白质印迹分析显示，bEnd.3培养液提取物高度表达Exo标志物Alix和Tsg101。共聚焦显微镜观察显示，Exo可被原代培养的小鼠大脑皮质神经元摄取，摄取的Exo广泛分布于胞质和突触。与OGD组比较，加入10 μg/ml和20 μg/ml IPC Exo可显著提高神经元活力( P<0.05)，而加入Sham Exo则无神经保护作用。 结论:IPC脑血管内皮细胞释放的Exo对OGD神经元具有保护作用。

目的:探讨咪达唑仑对被剥夺氧和葡萄糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)后的N2a/APP695细胞淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)代谢变化的影响及机制。方法:将处于对数生长期的N2a/APP695细胞用平衡盐缓冲液冲洗后随机分为空白组、对照组及实验组。空白组未经OGD处理，在正常培养箱内培养；对照组行OGD处理后继续培养复氧；实验组在OGD处理后加入不同浓度(分别为70、100、125、150 ng/ml)的咪达唑仑继续培养复氧。24 h后用AnnexinV-FITC/双染法流式细胞术检测各组细胞凋亡比例；用Western blot方法检测各组细胞的Caspase-3、Aβ 1-42、解整合素金属蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)、β-淀粉样前体蛋白水解酶1(β-site APP cleavage enzyme-1，BACE1)、早老素1(presenilin 1，PS1)蛋白水平。 结果:与空白组相比，对照组的细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ 1-42、BACE1及PS1水平显著升高( P<0.05)；APP及ADAM10水平无明显变化( P>0.05)。与对照组相比，实验组细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ 1-42显著下降( P<0.05)；咪达唑仑70 ng/ml组BACE1显著下降( P<0.05)，而APP、ADAM10及PS1无明显变化( P>0.05)。 结论:OGD可通过上调BACE1及PS-1导致Aβ 1-42表达增加促使细胞凋亡；而咪达唑仑可通过下调BACE1减少Aβ 1-42表达进而减少神经细胞凋亡，发挥对OGD损伤后N2a/APP695细胞的保护作用。

目的:探讨唑尼沙胺（zonisamide, ZNS）对创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）糖氧剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）细胞模型的保护作用及其机制。方法:体外培养人神经母细胞瘤（human neuroblastoma cells, SH-SY5Y）细胞，按随机数字表法分为对照组（Control组）、糖氧剥夺组（OGD组）和给药组（OGD+ZNS组）。采用糖氧剥夺法建立创伤性脑损伤细胞模型。造模后，检测细胞活性；检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放情况；β-半乳糖苷酶试剂盒对细胞染色，观察细胞衰老情况；线粒体红色荧光探针（Mito Tracker Red）、JC-1线粒体膜电位试剂盒对线粒体染色，观察线粒体形态及膜电位变化；检测细胞ATP浓度；从SH-SY5Y细胞中提取蛋白，用蛋白质印迹法（Western blot）法检测内质网应激相关指标：葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78），增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein antibody，CHOP）、蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）以及内参β-肌动蛋白（β-actin）的表达变化。结果:OGD组细胞存活率较Control组明显减少（ P<0.01），OGD+ZNS组细胞存活率较OGD组明显增加（ P<0.01）；OGD组LDH释放率较Control组明显增加（ P<0.01），OGD+ZNS组LDH释放率较OGD组明显减少（ P<0.01）。细胞染色结果显示，与Control组和OGD+ZNS组相比，OGD组细胞明显受损衰老严重，染色更深。线粒体染色结果显示，与Control组和OGD+ZNS组相比，OGD组线粒体线性连接明显减少，线粒体活性明显下降。与Control组和OGD+ZNS组相比，OGD组细胞线粒体染色红色荧光明显减弱，绿色荧光明显增强，线粒体膜电位明显下降；OGD组ATP浓度较Control组明显下降（ P<0.01），OGD+ZNS组ATP浓度较OGD组明显上升（ P<0.01）。Western blot结果显示OGD组GRP78、CHOP、PDI表达较Control组明显增加（ P均<0.05），OGD+ZNS组GRP78、CHOP、PDI较OGD组明显下降（ P均<0.05）。 结论:唑尼沙胺可以通过保护线粒体活性以及抑制内质网应激保护创伤性脑损伤糖氧剥夺细胞模型。

目的:探讨建立1日龄新生大鼠海马脑片离体培养及氧葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型的方法，为早产儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)基础研究提供方法。方法:选择1日龄新生SD大鼠40只，分离海马，切成400 μm厚脑片，分别培养1 d、3 d、5 d、7d、10 d、15 d、21 d，观察海马脑片的形态学变化，并通过碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性检测法评估脑片培养过程中活力情况；取培养稳定的海马脑片进行OGD，按是否行OGD及OGD时间分为正常组、OGD 1 h组、1.5 h组、2 h组、2.5 h组、3 h组、3.5 h组，用PI染色法和LDH活性检测法评估海马脑片损伤情况，明确制作OGD模型最佳OGD时间。结果:(1)海马脑片活力：海马脑片培养1 d后PI染色可见大面积红色强荧光，之后逐渐减少，5 d及以后基本消失；1 d时LDH活性最高，5 d时较1 d、3 d明显下降( P<0.05)，5～15 d LDH活性稳定。(2)OGD时间确定：OGD后正常培养24 h，OGD 1 h组、1.5 h组、2 h组海马脑片荧光微弱，与正常组比较差异无统计学意义( P>0.05)；OGD 2.5 h组海马CA区可见强荧光，OGD 3 h组、3.5 h组海马CA区、齿状回(dentate gyrus，DG)区均出现强荧光，3组LDH活性均较正常组明显升高( P<0.05)，推荐OGD时间为3 h。 结论:1日龄新生大鼠海马脑片培养第5～15天生长稳定，是后续实验的最佳时间段；培养5 d后行OGD 3 h可以建立稳定的海马脑片OGD模型。

目的:研究转录激活因子6（ATF6）与需肌醇酶1-X-框结合蛋白1（IRE1-XBP1）在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤小鼠海马神经元（HT22）细胞中的交互作用。方法:复制OGD/R损伤HT22细胞模型，观察OGD/R后不同时间点（0、3、6、12、24 h）内质网应激（ERS）、细胞活性和凋亡的变化。将对数生长期的HT22细胞分为空白对照组、对照+ATF6激动剂AA147组、对照+IRE1抑制剂4μ8c组、OGD/R模型组、OGD/R+AA147组、OGD/R+4μ8c组（AA147组和4μ8c组于全程添加10 μmol/L AA147或16 μmol/L 4μ8c）。采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测各组HT22细胞ERS相关蛋白〔葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、磷酸化需肌醇酶1（p-IRE1）、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（p-eIF2α）〕以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、活化caspase-3的表达；采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测ERS相关基因以及ATF6〔同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1（Herpud1）、蛋白二硫键异构酶家族成员4（Pdia4）、Lin-12样抑制子/增强子（Sel1L）〕和剪接型X-框结合蛋白1〔XBP1s，包括DnaJ热休克蛋白成员B9（Erdj4）、Sec24相关基因家族成员D（Sec24d）、信号受体序列3（Ssr3）〕介导的转录反应相关基因的mRNA表达；采用细胞增殖与毒性检测试剂盒（CCK-8）检测细胞活性；采用免疫荧光法检测活化caspase-3表达。结果:与空白对照组比较，ERS相关蛋白p-IRE1和p-eIF2α的蛋白表达量分别在OGD/R 12 h、OGD/R 3 h升高（p-IRE1/β-actin：2.09±0.10比1.00±0.00，p-eIF2α/β-actin：1.39±0.11比1.00±0.00，均 P<0.01），ERS相关基因ATF6、XBP1s、非剪接型X-框结合蛋白1（XBP1u）、转录激活因子4（ATF4）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的mRNA表达量在OGD/R后不同时间点也明显升高，表明ERS在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较，OGD/R+AA147组p-IRE1蛋白表达量无改变，但XBP1s和XBP1u的mRNA表达量明显下降〔XBP1s（2 -ΔΔCt）：0.76（0.71，0.92）比1.13（1.03，1.29），XBP1u（2 -ΔΔCt）：0.29±0.05比0.52±0.04，均 P<0.01〕，而XBP1s介导的转录反应相关基因表达量无明显改变。与OGD/R模型组比较，在使用4μ8c后短链ATF6（sATF6）和GRP78的蛋白表达量无明显改变，ATF6介导的转录反应相关基因的mRNA也无明显改变。提示ATF6的激活能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达，但ATF6与XBP1s介导的转录反应无交互作用。与空白对照组比较，HT22细胞活性在OGD/R 3 h时显著降低〔（44.64±5.12）%比（99.13±5.76）%， P<0.01〕，凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值分别在OGD/R 3 h和OGD/R 0 h显著升高（Bax/Bcl-2比值：6.15±1.65比1.00±0.00，活化caspase-3/caspase-3比值：17.48±2.75比1.00±0.00，均 P<0.01），表明凋亡在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较，OGD/R+AA147组细胞活性显著下降〔（36.52±17.78）%比（69.90±9.43）%， P<0.01〕，Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值明显升高（Bax/Bcl-2比值：2.06±0.31比1.10±0.25，活化caspase-3/caspase-3比值：3.35±0.59比0.55±0.09，均 P<0.01）。 结论:在OGD/R损伤HT22细胞中，ATF6和XBP1s介导的转录反应无明显交互作用，但AA147激活的ATF6能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达并促进应激HT22细胞中死亡的发生。

目的:探讨趋化因子CCL21及其受体CCR7在缺血性脑白质损伤(white matter lesion, WML)中的表达及作用。方法:对C57Bl/6小鼠采用永久性双侧颈总动脉闭塞法(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAo)制备缺血性WML模型。伊文思蓝灌注染色评估血脑屏障通透性。应用免疫荧光染色检测CCL21及其受体CCR7在缺血性WML组织中的表达。对脑微血管内皮细胞进行氧葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)制备体外缺血性WML模型，在OGD 6 h复氧24 h后采用蛋白质印迹分析检测CCL21蛋白表达水平。应用重组CCL21对原代培养的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)进行处理，然后加入脂多糖诱导炎症反应，通过定量聚合酶链反应检测成熟少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)mRNA表达水平。结果:与假手术组相比，BCCAo后脑组织内伊文思蓝染液渗出显著增多( P<0.05)，脑血管内皮细胞CCL21表达水平显著下调( P<0.05)，OPCs的CCR7表达水平显著下调( P<0.05)。脑微血管内皮细胞OGD后，CCL21蛋白表达水平较对照组显著下调( P<0.05)。重组CCL21处理OPCs后，MBP mRNA表达水平显著上调( P<0.05)。 结论:WML后CCL21/CCR7表达显著下调，应用重组CCL21能促进OPCs细胞分化和成熟，提示其可能在缺血性WML中发挥着重要作用。

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对大鼠脊髓损伤(SCI)后微血管内皮细胞(EC)葡萄糖转运体1(GLUT1)表达的作用及机制。方法:改良Allen’s法制作Sprague-Dawley大鼠SCI模型，观察SCI 1 d后抑制HMGB1作用脊髓GLUT1表达。培养大鼠脑脊髓EC，建立氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型，观察减少HMGB1对OGD 6 h/R 12 h处理EC的GLUT1表达的作用。使用Toll样受体4(TLR4)、TRIF及核转录因子-κB(NF-κB)的激动剂或抑制剂，激动或抑制通路蛋白作用，观察TLR4/TRIF/NF-κB通路在体内外HMGB1调节GLUT1表达中的作用。统计学方法采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey’s检验。结果:SCI 1 d后大鼠脊髓GLUT1表达增高(SCI 1 d组高于sham组，1.655±0.083比1.000±0， q＝24.580， P<0.01)。丙酮酸乙酯(实验组低于SCI组，1.356±0.096比2.107±0.115， q＝14.730， P<0.01)或甘草甜素(实验组低于SCI组，1.311±0.093比2.107±0.115， q＝15.620， P<0.01)抑制HMGB1作用减少SCI 1 d大鼠脊髓GLUT1表达。SC 1 d大鼠激动TLR4增加GLUT1表达(实验组高于SCI组，1.880±0.120比1.655±0.076， q＝5.032， P<0.05)，抑制TRIF(实验组低于SCI组1.427±0.118比1.655±0.076， q＝5.109， P<0.05)或抑制NF-κB(实验组低于SCI组1.301±0.076比1.655±0.076， q＝7.948， P<0.01)都可减少GLUT1表达。体外培养的脑脊髓EC，加入含HMGB1的星形胶质细胞条件培养基(ACM)并进行OGD 6 h/R 12 h处理后增加GLUT1表达(OGD 6 h/R 12 h组高于Normal组，2.122±0.075比1.000±0， q＝38.720， P<0.01)，减少ACM内HMGB1含量降低GLUT1表达(实验组低于OGD 6 h/R 12 h组，1.316±0.131比1.950±0.166， q＝8.737， P<0.01)。抑制TLR4(CLI-095：实验组低于OGD 6 h/R 12 h组，1.753±0.103比2.230±0.103， q＝13.515， P<0.01；C34：实验组低于OGD 6 h/R 12 h组，1.306±0.038比2.230±0.103， q＝16.440， P<0.05)，抑制TRIF(实验组低于OGD 6 h/R 12 h组，1.383±0.027比2.230±0.103， q＝23.750， P<0.05)或抑制NF-κB(实验组低于OGD 6 h/R 12 h组，1.149±0.064比2.230±0.103， q＝17.510， P<0.05)都可减少加入ACM并进行OGD 6 h/R 12 h处理的EC的GLUT1表达。 结论:抑制HMGB1作用减少SCI后EC的GLUT1表达，HMGB1通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路发挥上述调节作用。

目的:探讨可卡因－苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript, CART)对氧葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)小鼠皮质神经元突触结构的影响。方法:选用健康清洁级昆明小鼠16～17 d孕龄胚胎大脑皮质进行原代神经元培养，分为对照组、CART组、OGD组以及OGD＋CART组。OGD＋CART组在OGD处理后加入0.4 nmol/L CART 55-102培养12 h；CART组予以等剂量CART 55-102。采用流式细胞术检测神经元死亡率。通过免疫荧光分析观察神经元突触结构变化，并对轴突长度和突触蛋白Ⅰ阳性面积进行定量分析。采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹分析检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)mRNA和蛋白表达。 结果:与对照组比较，OGD组神经元死亡率显著增高，神经元突触生长明显受到抑制，突触蛋白Ⅰ阳性面积显著缩小，BDNF mRNA和蛋白表达水平显著下调( P均<0.05)。与OGD组比较，加入CART 55-102后能显著降低OGD神经元死亡率( P<0.05)，逆转OGD对神经元突触生长的抑制作用，使神经元轴突长度及突触蛋白Ⅰ阳性面积显著增大( P均<0.05)，并显著上调BDNF mRNA和蛋白表达水平( P均<0.05)。 结论:CART能保护OGD小鼠脑皮质神经元的突触结构，其机制可能与上调BDNF表达有关。

目的:探讨miR-26a介导磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)信号通路对脑缺血大鼠血管生成的影响。方法:将100只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、miR-NC组和miR-26a组。miR-NC组和miR-26a组分别侧脑室注射5 μl miR-26a模拟物阴性质控品和miR-26a模拟物，假手术组和模型组注射等量生理盐水。采用改良线栓法制作大脑中动脉闭塞模型，假手术组只插线不结扎。各组大鼠各取5只腹腔注射5-溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)，1次/d，连续7 d。将体外培养并转染的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)分为对照组、氧葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)组、miR-NC组和miR-26a组。双荧光素酶实验验证miR-26a对第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10, PTEN)的调控作用。应用Longa评分检测大鼠神经功能损伤。氯化三苯四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法测定脑梗死体积。分别使用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)染色法、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法和小管形成实验测定BMECs增殖、凋亡和血管生成。应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测缺血脑组织及BMECs miR-26a表达。免疫荧光双标记法[BrdU/von Willebrand因子(von Willebrand factor, vWF)]检测大鼠血管内皮细胞增殖。蛋白质印迹分析检测缺血脑组织血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2)、PTEN、PI3K、AKT表达。结果:生物信息学及双荧光素酶实验验证了miR-26a对PTEN的靶向调控。与假手术组比较，模型组和miR-NC组缺血脑组织miR-26a、VEGF、bFGF、Ang-2、PI3K、AKT表达和BrdU +/vWF +细胞数量增加，而PTEN表达降低( P均<0.05)；与模型组比较，miR-26a组各项指标效果更加显著( P均<0.05)。与对照组比较，OGD组和miR-NC组BMECs增殖和血管生成能力显著增强，细胞凋亡显著减少( P均<0.05)；与OGD组比较，miR-26a组各项指标效果更加显著( P均<0.05)。 结论:miR-26a能靶向抑制PTEN表达，通过激活PI3K/AKT信号通路上调血管生成相关因子(VEGF、bFGF和Ang-2)，促进脑梗死大鼠血管内皮细胞增殖和血管生成。