目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-630对膀胱尿路上皮癌侵袭转移的调控作用及其分子机制。方法:通过生物信息学预测，APC膜募集蛋白(Amer2)为miR-630下游靶基因。构建含miR-630结合位点的Amer2基因3’端非编码区(3’UTR)荧光素酶报告载体，检测miR-630与Amer2的3’UTR相互作用对荧光素酶活性的影响。miR-630模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)用脂质体(Lipofectamine) 2000在体外瞬时转染膀胱癌细胞株EJ，转染72 h后采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测Amer2、鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF-H1)的表达；蛋白质印迹法(Western blot)检测Amer2、GEF-H1蛋白的表达变化；细胞划痕实验、Transwell小室体外侵袭实验反映细胞增殖、转移潜能的变化，组间比较采用两独立样本 t检验。 结果:转染miR-630 mimics后，Amer2荧光海肾素酶活性低于对照组，差异有统计学意义(13.885±1.624比22.182±1.354， t＝-6.885， P<0.05)；转染miR-630 mimics后，膀胱癌细胞株EJ中Amer2的表达量明显低于对照组(11.786±4.123比8.327±3.863， t＝5.780， P<0.05)，差异有统计学意义，实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及Western blot结果显示GEF-H1基因及蛋白的表达水平明显高于对照组(9.886±5.422比13.565±4.476， t＝5.420， P<0.05)，差异有统计学意义；转染miR-630 inhibitor后，体外实验表明膀胱癌细胞的迁移活性[(42.320±4.183)%比(35.528±5.433)%， t＝5.825]和侵袭能力[(49.180±5.677)%比(40.422±6.266)%， t＝7.377， P<0.05]明显低于对照组，差异有统计学意义。 结论:MiR-630在膀胱尿路上皮癌中高表达，可能通过调控Amer2/GEF-H1通路增强肿瘤细胞增殖，诱导膀胱癌细胞侵袭转移。

目的:探讨环状RNA(circRNA）＿0128846对人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞放射抵抗的影响及机制。方法:应用GEO数据库筛选、采用荧光实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测在人NSCLC细胞A549及其放射抵抗细胞（A549R）中差异表达最显著的circRNA作为目标circRNA，qRT-PCR检测其在人支气管上皮细胞Beas-2B及人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975中的表达水平。在A549细胞中转染目标circRNA过表达载体，在A549R细胞中转染目标circRNA沉默载体，并检测以上细胞经8 Gy X射线照射后的克隆形成能力。应用人类环状RNA数据库和circinteractome数据库预测目标circRNA下游的miRNA，qRT-PCR检测A549R细胞中目标circRNA沉默后表达水平上升最显著的miRNA作为目标miRNA。qRT-PCR检测A549细胞中过表达目标circRNA后目标miRNA的表达情况；通过双荧光素酶报告基因分析人胚肾细胞293T中过表达目标miRNA后目标circRNA的表达情况；qRT-PCR检测目标miRNA在A549、A549R细胞中的表达水平。在A549细胞中转染目标miRNA抑制剂以沉默目标miRNA，在A549R细胞中转染目标miRNA模拟物以过表达目标miRNA，并检测以上细胞经8 Gy X射线照射后的克隆形成能力；将过表达目标circRNA的A549细胞进行8 Gy X射线照射并在该细胞中过表达目标miRNA，检测细胞的克隆形成能力。组间数据的比较采用独立样本 t检验。 结果:qRT-PCR检测结果显示，circRNA_0128846为目标circRNA，且其在人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975中的相对表达水平均高于人支气管上皮细胞Beas-2B（ t=6.200、7.903、6.010、6.132，均 P<0.01）。过表达circRNA_0128846的A549细胞经照射后的克隆形成能力增强（0.22%对0.45%， t=4.427， P<0.05）；沉默circRNA_0128846后A549R细胞经照射后的克隆形成能力降低（0.23%对0.10%， t=3.780， P<0.05）。qRT-PCR检测结果显示，miR-1183为目标miRNA，在A549细胞中过表达circRNA_0128846显著下调miR-1183的表达（ t=6.002， P<0.01）；双荧光素酶报告基因分析证实过表达miR-1183可显著下调circRNA_0128846的表达（ t=4.562， P<0.05）；miR-1183在A549R细胞中的相对表达水平显著低于亲本A549细胞（ t=6.025， P<0.01）。过表达miR-1183显著降低A549R细胞经照射后的克隆形成能力，沉默miR-1183显著增强A549细胞经照射后的克隆形成能力（0.26%对0.15%、0.21%对0.31%， t=3.671、3.293，均 P<0.05），且过表达miR-1183显著降低了过表达circRNA_0128846对A549细胞克隆形成能力的促进作用（1.90%对1.20%， t=6.325， P<0.01）。 结论:circRNA_0128846作为miR-1183的吸附海绵，可抑制miR-1183的表达进而抑制其放疗增敏作用，从而促进人NSCLC细胞的放射抵抗。

目的:研究VPS26在高脂环境中对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）成骨、成脂分化作用的机制，探讨VPS26对高脂大鼠种植体骨结合和裸鼠异位成骨的影响。方法:普通成骨诱导液（成骨组）和高脂成骨诱导液（高脂组）培养BMSC，高脂组促进或抑制VPS26的表达，检测成骨和成脂相关基因的表达。细胞诱导第7、14天后行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和油红O染色；成骨组细胞采用免疫荧光染色和免疫共沉淀方法检测VPS26与β-联蛋白（β-catenin）的结合，双荧光素酶报告实验检测萤火虫荧光值/海肾荧光值（以下简称TOP/FOP）比值。取18只雄性12周龄高脂血症Wista大鼠（体质量为160~200 g），于其双侧股骨干骺端植入种植体，分为3组，每组6只，分别注射VPS26过表达慢病毒（LV-VPS26组）、阴性对照慢病毒（LV-nc组）和生理盐水（空白对照组），种植体及周围骨组织行显微CT分析和HE、油红O染色评估种植体骨结合和股骨脂滴形成。20只雌性6周龄裸鼠（体质量为30~40 g）均分为5组，每组4只，于背部皮下分别植入不转染和转染了LV-VPS26、LV-nc、shVPS26、shscr慢病毒的成骨组BMSC，取样观察异位成骨。结果:过表达VPS26后高脂组BMSC中ALP的mRNA表达水平（1.56±0.09）显著高于阴性对照（1.01±0.03）（ t=10.09， P<0.001），过氧化物酶增殖物活化受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）和脂肪酸结合蛋白4（fatty acid-binding protein4，FABP4）的mRNA表达水平则显著低于阴性对照（ t=6.44， P<0.001； t=10.01， P<0.001）。蛋白质印迹法结果显示过表达VPS26后高脂组BMSC中ALP、Runt相关转录因子2的蛋白表达较阴性对照增强，PPAR-γ、FABP4则减弱，高脂组骨髓间充质干细胞ALP活性在过表达VPS26后更强，脂滴的形成较阴性对照更弱，数量更少。免疫荧光染色、免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验结果显示VPS26与β-catenin存在共定位和相互作用，且TOP/FOP比值显著上升43.10%（ t=-3.17， P=0.034）。VPS26过表达后高脂大鼠种植体骨结合增强而脂滴数量下降，HE染色结果显示VPS26过表达后裸鼠皮下支架周围组织骨量增多。 结论:VPS26通过Wnt/β-catenin通路激活BMSC成骨分化且抑制成脂分化，具有促进高脂大鼠种植体骨结合和裸鼠异位成骨的作用。

目的:探讨miRNA-1-3p（miR-1-3p）对骨肉瘤细胞肌细胞增强因子2A（MEF2A）表达及生物学功能的影响。方法:收集2019年1月至2020年1月山西省肿瘤医院临床确诊的20例骨肉瘤患者的肿瘤组织及癌旁正常组织，使用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测样本中miR-1-3p表达水平。采用qRT-PCR检测骨肉瘤细胞株U2-OS、SAOS-2、MG63、SW1353及人正常成骨细胞株hFOB1.19中miR-1-3p表达水平，选择miR-1-3p表达水平最低的细胞株进行后续实验。构建过表达miR-1-3p载体（miR-1-3p mimcs），转染miR-1-3p mimcs的细胞为miR-1-3p过表达组，转染空载体（miR-1-3p nc）的细胞为对照组；使用CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期变化。采用miRwalk网站工具预测miR-1-3p靶基因，并通过双荧光素酶报告基因实验进行验证；蛋白质印迹法检测各组细胞MEF2A蛋白的表达。结果:与癌旁组织相比，骨肉瘤组织中miR-1-3p表达下调（0.31±0.14比0.62±0.21），差异有统计学意义（ t=5.31， P<0.01）。miR-1-3p在骨肉瘤U2-OS细胞中表达最低；与对照组相比，miR-1-3p过表达组细胞U2-OS细胞增殖活性受抑制（48 h吸光度值0.56±0.01比0.77±0.03， t=2.77， P<0.01；72 h吸光度值0.87±0.02比1.40±0.03， t=2.93， P<0.01），细胞周期G 1至S期阻滞增加[G 1期（38.24±0.55）%比（32.11±0.80）%， t=9.27， P=0.01；S期（61.24±0.90）%比（67.78±0.83）%， t=7.52， P=0.02]，细胞早期凋亡率升高[（11.20±0.12）%比（1.50±0.12）%， t=2.91， P<0.05]。miRwalk网站工具预测miR-1-3p靶基因为MEF2A。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-1-3p和MEF2A 3'UTR靶向结合，miR-1-3p过表达组U2-OS细胞荧光素酶活性低于对照组（海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶活性比值0.53±0.06比1.00±0.04， t=4.04， P<0.05）；蛋白质印迹法结果显示，miR-1-3p过表达组U2-OS细胞MEF2A蛋白表达水平较对照组低（蛋白相对表达量0.41±0.14比0.77±0.12， t=3.93， P<0.05）。 结论:miR-1-3p低表达可能与骨肉瘤细胞增殖、凋亡和周期改变相关。miR-1-3p可负向调控MEF2A蛋白表达并调控骨肉瘤的发生、发展。

目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-96通过靶向叉头框转录因子O1(FOXO1)促进肺癌细胞增殖和迁移的作用。方法:应用茎环反转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测miR-96在肺癌细胞株中的表达；干扰慢病毒感染抑制miR-96表达后，分别利用细胞增殖试验(CCK-8)和划痕试验检测其对肺癌细胞增殖和迁移的影响；蛋白质印迹法(Western blot)和双荧光素酶活性试验验证miR-96靶基因FOXO1。应用GraphPad Prism 5统计学软件进行分析，计量资料比较采用 t检验。 结果:CCK-8实验显示抑制H1299细胞miR-96表达后，实验组24、48、72 h吸光度值分别为1.293±0.019、1.684±0.038、2.180±0.034，明显低于对照组的1.655±0.056、1.880±0.020、2.493±0.060，差异有统计学意义( t＝5.646、4.426、14.670， P<0.01)；划痕试验显示对照组4 h和10 h细胞迁移率为(29.21±3.96)%、(47.49±3.33)%，明显高于实验组[(5.80±2.94)%、(13.63±3.18)%]，差异有统计学意义( t＝4.748、7.352， P<0.01)；筛选miR-96靶基因FOXO1，将miR-96过表达后，肺癌细胞FOXO1表达明显降低；反之，抑制miR-96表达后，FOXO1表达明显增高。荧光素酶活性试验显示miR-96和FOXO1 3’非翻译区(3’UTR)野生型质粒共转染后，野生型为(22.5±7.6)%，与对照组的(97.2±13.2)%及突变型的(115.6±13.5)%比较，荧火虫/海肾荧光素酶比值明显降低( t＝14.750、12.040， P值均<0.01)。 结论:miR-96通过靶向调控FOXO1促进肺癌细胞增殖和迁移。

目的:研究miRNA-326是否作用于其靶基因 BCL- XL，探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。 方法:利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统，分别构建含有 BCL- XL 3′端非翻译区(3′ untranslated region，3′UTR)片段的野生型和变异型的双荧光素酶载体，设置对照组，转染细胞检测相对荧光强度。 结果:分别构建了PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-WT(野生型)和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-MT(变异型)的双荧光素酶报告基因质粒载体；miRNA-326序列和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-WT质粒共转染测定的相对荧光强度显著低于对照组(miRNA-326阴性对照序列和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-WT质粒共转染组)( P＝0.034)；同时也显著低于miRNA-326序列和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-MT质粒共转染的变异组( P＝0.022)。 结论:miRNA-326作用于 BCL- XL基因的3′UTR；这为研究miRNA调控血小板凋亡的分子机制奠定了基础。

目的:构建一种能够验证内部核糖体进入位点的双荧光素酶报告载体，为验证内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)活性提供了方法。方法:以双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2为基础，将发卡结构插入到海肾荧光素酶(R-Luc)基因与萤火虫荧光素酶(F-Luc)基因之间，构建载体psiCHECK-IRES。为了验证载体是否有效，通过同源重组技术将Encephalomyocarditis virus(EMCV)的IRES序列插入到psiCHECK-IRES载体的发卡结构与F-Luc之间，形成载体psiCHECK-IRES-EMCV。以psiCHECK-2质粒做模板建立F-Luc与R-Luc的扩增标准曲线。将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒转染BHK-21细胞，利用RT-qPCR检测F-Luc与R-Luc的拷贝数；将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒分别转染BHK-21细胞，24 h后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果:经过测序证实带有发卡样结构的双荧光素酶表达载体psiCHECK-IRES的载体序列。RT-qPCR结果显示F-Luc与R-Luc mRNA的拷贝数大致相同，证明未出现异常的单顺反子转录本，避免F-Luc读数出现假阳性；插入EMCV IRES的psiCHECK-IRES-EMCV载体表达的F-Luc/R-Luc比值是空载体的53.35倍，证明EMCV的IRES序列能够在构建的载体上起始F-Luc基因的表达。结论:本研究构建了可用于验证病毒或者细胞依赖IRES表达的双荧光素酶报告载体psiCHECK-IRES。

目的:探讨微小RNA（miR）-23a是否通过靶向10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源（PTEN）基因抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路诱导的心肌细胞肥大。方法:将大鼠心肌细胞株H9c2细胞置于DMEM高糖培养基中，于37 ℃ 5% CO 2培养箱中培养，作为正常组。稳定培养48 h后，采用10 nmol/L血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激H9c2细胞构建细胞肥大模型，为AngⅡ组。将H9c2细胞接种于培养板中，置于37 ℃培养箱中培养，待细胞生长汇合度约70%时，使用不同试剂转染细胞，转染24 h后以10 nmol/L AngⅡ干预细胞。其中，转染miR-23a抑制剂的细胞为AngⅡ+anti-miR组，转染miR-23a抑制剂阴性对照者为AngⅡ+NC组，共转染miR-23a抑制剂和PTEN小干扰RNA（siRNA）者为AngⅡ+anti-miR+si-PTEN组，共转染miR-23a抑制剂和PTEN siRNA阴性对照者为Ang Ⅱ+anti-miR+si-NC组。采用Image J软件测定单细胞表面积，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中心肌肥厚标志基因α-肌动蛋白1（ACTA1）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）基因mRNA和miR-23a的表达水平，Western blot检测细胞中PTEN蛋白和AMPK信号通路相关蛋白表达水平。为验证miR-23a是否靶向作用于PTEN基因，进行双荧光素酶报告基因实验。构建野生型pGL-WT-PTEN和突变型pGL-MUT-PTEN的荧光素酶报告基因载体重组质粒，测序正常后备用。H9c2细胞接种到24孔细胞培养板中，置37 ℃培养箱培养过夜，将miR-23a模拟物或miR-23a模拟物阴性对照与野生型或突变型报告基因重组质粒共转染细胞。转染48 h后测定萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，以二者比值作为相对荧光素酶活性。 结果:AngⅡ组的细胞表面积、ACTA1和β-MHC mRNA及miR-23a的表达水平明显高于正常组，而PTEN及p-AMPK蛋白表达水平明显低于正常组（ P均<0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-23a模拟物与野生型报告基因重组质粒共转染细胞的相对荧光素酶活性比miR-23a模拟物阴性对照共转染者低（ P<0.05），PTEN是miR-23a的靶基因。与AngⅡ组和AngⅡ+NC组比较，AngⅡ+anti-miR组细胞中miR-23a、ACTA1和β-MHC mRNA的表达水平更低，细胞表面积更小，PTEN和p-AMPK蛋白表达水平更高（ P均<0.05）。与AngⅡ+anti-miR组比较，AngⅡ+anti-miR+si-PTEN组细胞表面积较大，ACTA1和β-MHC mRNA的表达水平较高，PTEN和p-AMPK蛋白表达水平较低（ P均<0.05）。 结论:抑制miR-23a能够减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，其作用机制可能与miR-23a靶向PTEN抑制AMPK信号通路有关。

目的:建立四跨膜蛋白7自身抗体（TSPAN7A）的荧光素酶免疫共沉淀检测技术（LIPS），并评估TSPAN7A在中国1型糖尿病（T1D）人群中的应用价值。方法:将插入人全长四跨膜蛋白7 cDNA的海肾荧光素酶重组质粒转染293T细胞，获得含四跨膜蛋白7与海肾荧光素酶融合蛋白的细胞裂解液。待测血清与该细胞裂解液孵育过夜后，用蛋白A-琼脂糖沉淀免疫复合物，洗涤，加入海肾荧光素酶底物并检测荧光读数，以199名健康对照的第99百分位数作为阳性阈值。采用LIPS法检测2014至2017年中南大学湘雅二医院代谢内分泌科就诊的100例T1D患者［男64例，女36例，年龄（28±16）岁］、119例2型糖尿病（T2D）患者［男78例，女41例，年龄（47±12）岁］以及98名健康对照［男55名，女43名，年龄（28±12）岁］血清中TSPAN7A水平。同时采用放射配体法（RLA）检测谷氨酸脱羧酶自身抗体（GADA）、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体（IA-2A）、锌转运体8自身抗体（ZnT8A）水平，初步评估TSPAN7A的临床应用价值。结果:100例T1D患者中GADA、IA-2A、ZnT8A、TSPAN7A的阳性率分别为72.0%、40.0%、29.0%、25.0%，经Bonferroni法校正后，TSPAN7A阳性率低于GADA（ P<0.001），而与IA-2A（ P=0.035）和ZnT8A比较差异无统计学意义（ P=0.630）。T1D患者TSPAN7A阳性率高于T2D的0.84%（1/119；25.0%比0.84%， P<0.001）和健康对照的1.02%（1/98；25.0%比1.02%， P<0.001）。在其他抗体基础上联合检测TSPAN7A可使T1D抗体阳性检出率由82.0%提高至85.0%。TSPAN7A阳性T1D患者与其他3种胰岛自身抗体阳性者临床特征差异均无统计学意义（均 P>0.05）。 结论:本研究成功建立了TSPAN7A的荧光素酶免疫共沉淀检测技术，TSPAN7A是中国T1D人群的一种新型胰岛抗体。

目的:探讨lncRNA LUCAT1 通过调控miR-141-3p/SOX11 轴对肾透明细胞癌细胞(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)的生长和转移的影响.方法:利用生信分析LUCAT1 在KIRC中的表达,并预测下游的miRNA/mRNA调控轴;qRT-PCR用于检测LUCAT1、miR-141-3p和SOX11 的表达,Western blot用于检测SOX11 的表达;细胞生物学功能实验观察KIRC细胞的增殖、迁移和侵袭状况;双荧光素酶实验验证LUCAT1 和miR-141-3p以及miR-141-3p和SOX11 靶向结合关系;RIP实验验证LUCAT1 和miR-141-3p的结合关系;裸鼠实验观察LUCAT1 对肿瘤体内生长的影响.结果:通过生信分析和细胞实验发现LUCAT1 和SOX11 在KIRC中高表达,miR-141-3p在KIRC中低表达;MTT、伤口愈合和细胞侵袭实验结果显示LUCAT1 促进KIRC细胞的增殖、迁移和侵袭.随后在双荧光素酶实验中显示LUCAT1 可以作为miR-141-3p的分子海绵,同时我们还证实miR-141-3p能回复LUCAT1 对KIRC细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用.进一步研究发现SOX11 是miR-141-3p的直接靶标,并且SOX11 能回复miR-141-3p对KIRC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用.最后我们还通过体内实验确定了LUCAT1 能促进KIRC肿瘤的体内生长.结论:LUCAT1 在KIRC中上调,并可以通过吸附miR-141-3p调控SOX11 促进KIRC的生长和转移.这表明LUCAT1 有望成为KIRC的生物标志物和潜在分子治疗靶点.