基于蛋白组学探讨灵芝酸X(ganoderic acid X,GAX)对人肝母细胞瘤HepG2、HuH6细胞模型和非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic-severe combined immune deficient,NOD-SCID)小鼠皮下移植瘤模型的作用机制,为灵芝酸X的临床应用提供依据.采用CCK-8法检测灵芝酸X对HepG2、HuH6细胞活力的影响;EdU实验检测灵芝酸X对细胞增殖的影响;划痕实验检测灵芝酸X对细胞迁移能力的影响;Hoechst 33258染色检测灵芝酸X对细胞凋亡的影响;建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型,分析对照组及灵芝酸X低、中、高剂量组(5、10、20 mg·kg-1)肿瘤体积和质量;苏木素-伊红(HE)染色评估灵芝酸X的药物毒性.此外,收集HepG2细胞对照组和灵芝酸X高剂量组的细胞,分别进行laber-free蛋白组学分析,筛选差异蛋白并富集相关信号通路,CYTO-ID?染色检测细胞自噬情况,Western blot实验检测相关蛋白的表达量.体外结果显示,灵芝酸X呈剂量依赖性抑制HepG2、HuH6细胞的增殖、迁移、诱导凋亡;体内研究显示灵芝酸X显著抑制肿瘤体积和质量,且对小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)无明显损害;laber-free蛋白组学结果显示灵芝酸X在肝母细胞瘤治疗过程中参与多种信号通路,其中自噬途径高度富集.CYTO-ID ?染色及Western blot结果显示灵芝酸X诱导细胞自噬并上调苄氯素1(Beclin-1)、自噬相关基因5(ATG5)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白表达量,下调螯合体1(p62)蛋白表达量.该研究表明,灵芝酸X通过诱导自噬进而抑制肝母细胞瘤细胞的增殖、迁移和诱导凋亡,并显著抑制肿瘤生长,是一种有希望的癌症辅助治疗药物.

采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap-HRMS)联用技术对灵芝醇提物的化学成分进行系统分析,总结其代表性化学成分的裂解规律,并对灵芝潜在作用于法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)靶点的抗肝纤维化活性物质进行研究,阐明其药效物质基础.初步鉴定出灵芝醇提物95种化学成分,包括灵芝酸类24种、灵芝烯酸类9种、赤芝酸类13种、丹芝酸类3种、灵芝内酯类1种、其他三萜类成分40种、脂肪酸类成分4种、其他类1种,并分析了其裂解规律.如灵芝酸、灵芝烯酸类成分的结构特征以C30为骨架,含有游离的-COOH及-OH,易失去H2O、CO2分子形成碎片离子,D环多为五元环,易发生断裂;赤芝酸类成分属于C27骨架的羊毛甾烷型,与灵芝酸类成分相比其侧链结构变短,由8个碳减少为5个,同灵芝酸类含有常见的游离-COOH、-OH,容易失去H2O、CO2分子.通过选取已报道的6种FXR受体激动剂组成训练集,建立基于FXR配体的药效团模型,以鉴定出的95种灵芝化学成分与药效团进行匹配,通过测试集分子对模型进行验证,选出最优药效团模型02(敏感性=0.750 00,特异性=0.555 56,ROC=0.750)用于对灵芝化合物库的虚拟筛选,经匹配筛选得到31种潜在的可用于激活FXR的灵芝活性成分,随后ADMET预测结果表明灵芝酸H和赤芝酸J与血浆蛋白的结合率低于90％,且无肝毒性,可作为FXR激活剂开发单用或联用治疗肝纤维化的临床药物.

目的 探讨灵芝孢子对糖尿病(DM)大鼠心肌损伤的保护作用及对PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(parkin)信号通路的作用机制.方法 将40 只雄性SD大鼠随机分成对照(NC)组、高脂高糖饮食(HFD)组、DM组和灵芝孢子(GLS)组各10 只.12 w末,记录各组末次体质量及空腹血糖.麻醉处死大鼠后,采集心脏组织,计算心脏指数,并检测丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量.苏木素-伊红染色(HE)和马松(Masson)染色观察心脏病理学变化.Western印迹检测PINK1/parkin通路蛋白、自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白,免疫组织化学技术验证PINK1、parkin的表达水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色评估细胞凋亡情况.结果 与NC组相比,HFD组体质量明显增加,DM组体质量明显减轻,血糖水平明显升高(P<0.05);HFD组和DM组心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、微管相关蛋白轻链(LC)3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2 同源结构域蛋白抗体(beclin)1、Bcl-2 相关X蛋白(Bax)/Bcl-2 蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率及血管周围胶原含量明显增加,SOD活性、p62 蛋白表达水平显著下降(均P<0.05).与DM组相比,HFD组和GLS组体质量、SOD活性、p62 蛋白表达水平明显增加,血糖水平、心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、LC3、beclin1、Bax/Bcl-2 蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、血管周围胶原含量明显降低(均P<0.05).结论 灵芝孢子可减轻DM大鼠心肌损伤,改善纤维化程度,具有良好的抗氧化活性,可逆转心肌细胞过度自噬,抑制细胞凋亡,其保护作用可能与下调PINK1/parkin信号通路有关.

龙芝2号和鹿角灵芝均为赤芝的栽培品种,且在生长发育过程中均不产生孢子.目前,尚缺乏对两者化学成分和药理活性的系统比较研究.本研究以灵芝两个无孢品种——龙芝2号和鹿角灵芝为原料,研究对比两者子实体水提物成分差异及免疫活性的强弱.采用化学及仪器分析相结合的方法,分析两者水提物中的多糖得率、含量、重均分子量分布特征及核苷、蛋白质、氨基酸含量差异,并研究了灵芝两个无孢品种水提物样品刺激RAW 264.7细胞释放NO活性.结果表明,两者多糖得率及含量差异不大,但龙芝2号中重均分子量分布范围较广,多糖分子量较大,其含有3种多糖,分子量分别为2.021×106、1.802×106和4.825×105,而鹿角灵芝中仅含有1种多糖,分子量为1.589x104;两者中含有的核苷种类相似,但各核苷的含量存在差异;鹿角灵芝和龙芝2号中蛋白质含量分别为10.70％和10.32％,两者均不含有组氨酸,蛋氨酸在两者中含量均较高,分别达到2.556％和2.591％.从鹿角灵芝和龙芝2号中得到的水提物样品均具有体外刺激巨噬细胞释放NO的活性.

目的 研究密生雪灵芝的化学成分.方法 利用硅胶柱层析、大孔吸附树脂、中压柱层析、Sephadex LH-20和反相C18半制备液相色谱等手段进行分离纯化,并通过1HNMR、13CNMR等波谱技术来鉴定结构.结果 从密生雪灵芝全草的正丁醇萃取物中分离得到了10个化合物,分别鉴定为:小麦黄素(I)、小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅱ)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(Ⅲ)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)、邻苯二甲酸二异丁酯(V)、没食子酸(Ⅵ)、山奈酚(Ⅶ)、槲皮素(Ⅷ)、芹菜素(Ⅸ)、杨梅素(X).结论 所有化合物均为首次从密生雪灵芝中分离得到.

通过氨基酸定点突变技术提高灵芝免疫调节蛋白LZ-8的热稳定性.通过分子动力学模拟结合温度因子预测对LZ-8氨基酸突变位点进行理性设计,在毕赤酵母X33菌株内构建并表达LZ-8突变体蛋白,采用HeLa细胞生长抑制实验和差示量热扫描分析检测并比较了LZ-8突变前后生物学活性及热力学参数.结果显示,LZ-8 N-端 α 螺旋为理论预测的温度敏感区域,在该区域进行F8W和R9K氨基酸双位点突变,突变后的LZ-8热稳定性提高,相变温度Tm上升0.92℃,相转变焓值 ΔH提高23.14 kJ/mol,但突变后LZ-8生物学活性基本不变,LZ-8和LZ-8突变体对HeLa细胞生长抑制的IC50值分别是2.238μg/mL和2.407μg/mL.通过理性设计氨基酸突变位点,获得了稳定性提高但生物学活性不变的灵芝免疫调节蛋白LZ-8的突变体.

灵芝是我国传统的食药用真菌,具有广泛的免疫调节功能并含有多种生物活性成分.灵芝酸是灵芝的主要次生代谢产物之一,具有较高商业价值.钙调蛋白(calmodulin,CaM)作为真核生物中重要的Ca2+信使,能够参与生长发育、次生代谢等重要生理过程.本研究通过序列分析发现,灵芝CaM基因序列编码149个氨基酸,与其他物种CaM蛋白高度保守.该蛋白含有4个完整的EF-hand结构域,并且在每个EF-hand结构域中,都含有一个保守的D-x-D基序.进一步构建筛选了灵芝CaM沉默转化子,检测CaM在灵芝生长发育及次生代谢过程中的功能.结果 显示,CaM沉默转化子中灵芝酸含量比WT降低约34％.沉默CaM后菌丝生长速率与WT相比降低40％.该结果说明CaM在灵芝生长及次生代谢过程中具有重要作用,为在真菌中研究CaM功能及调控途径提供参考.

本文采用水提醇沉法从灵芝孢子粉中提取其粗多糖,经Sepharose CL-6B凝胶柱层析分离得两种主要成分LBPⅠ和LBPⅡ,经高效液相色谱鉴定,均为高均一性成分,分子量分别为9.17x104和1.86x104;经酸水解、乙酰化和气相色谱分析,确定LBPⅠ的单糖组成为甘露糖、半乳糖和葡萄糖,LBPⅡ的单糖组成为鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖;通过高碘酸氧化、甲基化和GC-MS进行结构分析,确定LBPⅠ中葡萄糖残基连接方式为1→、1→4,6和1→3,6连接,半乳糖残基为1→6连接,甘露糖残基为1→3,6连接,LBPⅡ中鼠李糖残基连接方式为1→连接,葡萄糖残基为1→、1→4、1→6、1→4,6和1→3,6连接,半乳糖残基为1→6连接,甘露糖残基为1→2,3,6连接.综上,两种多糖LBPⅠ和LBPⅡ均为多分支的中型杂多糖,但两者的单糖组成和连接方式存在差异,这两种多糖成分均为首次报道,可望为灵芝孢子粉的成分、活性研究和资源开发提供理论依据.

目的:运用代谢组学方法分析灵芝多糖对辐射损伤小鼠内源性物质代谢的影响,寻找潜在的生物标志物并分析其代谢途径,探讨其作用机制.方法:将30只小鼠随机分为正常组、模型组和灵芝多糖组(给药剂量96 mg· kg-1),每组10只,前两组给予生理盐水,连续灌胃14d,在第7天灌胃后2h,除正常组外,模型组和灵芝多糖组小鼠以X射线进行全身照射.利用UPLC-Q-TOF-MS检测胸腺组织中内源性小分子代谢物,利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)比较正常组、模型组以及灵芝多糖组内源性小分子代谢物的变化情况,对差异代谢物进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)代谢通路分析.结果:鉴定出34个潜在生物标志物,与模型组相比,发现灵芝多糖组对L-谷氨酸、牛磺酸、磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)等均具有显著的逆转趋势,分别参与牛磺酸和亚牛磺酸代谢、甘油磷脂代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢.结论:灵芝多糖可能通过改善辐射模型小鼠胸腺中相关潜在生物标志物表达及其相关代谢通路来发挥辐射防护作用.

目的:研究雪灵芝提取物对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响,并探讨其潜在作用机制.方法:采用硅胶柱层析法对雪灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位进行分离,以二氯甲烷-甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,分别得到子部位Z1,Z2,Z3和Z4.运用CCK-8法检测不同质量浓度的4个子部位对HepG2增殖活性的作用,Hoechst 33258染色观察给药组HepG2细胞形态的变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡情况.采用Western blot法检测各组细胞中B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达水平.结果:4个子部位对HepG2细胞增殖具有不同程度的抑制作用,且子部位Z3,Z4的抑制作用相对更为显著;Hoechst 33258染色观察到经子部位Z3,Z4作用的HepG2细胞出现典型的细胞凋亡形态;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术证明了其对于HepG2细胞具有诱导凋亡作用;Western blot结果显示,在12.5～25μg·mL-1浓度范围内,子部位Z3能够下调Bc1-2表达并增加Bax的表达,使Bax/Bcl-2比值升高,从而促进凋亡发生;在6.25～25μg·mL-1浓度范围内,子部位Z4可通过下调Bcl-2和Cyclin D1的表达,实现促凋亡的作用.结论:雪灵芝乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位的子部位能够抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制Bcl-2,Cyclin D1蛋白表达有关.