目的:采用预定位技术在表皮生长因子受体(EGFR)阳性/阴性荷瘤鼠中探索西妥昔单克隆抗体(简称单抗；Cetuximab)靶向EGFR免疫PET显像的可行性。方法:以反式环辛烯(TCO)- N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰Cetuximab获得Cetuximab-TCO。以2，2′-((6-氨基-1-(4，7-双(羧甲基)-1，4，7-三氮烷-1-基)己烷-2-基)氮杂二酰基)二乙酸(L-NETA)为螯合剂，制备 68Ga-L-NETA-四嗪(Tz)分子探针，测定其标记率、稳定性。体外培养基底样乳腺癌细胞MDA-MB-468(EGFR+)和MDA-MB-231(EGFR-)，进行细胞摄取及阻断实验。用Balb/c-nu小鼠建立MDA-MB-468和MDA-MB-231皮下荷瘤鼠模型；将50 μg Cetuximab-TCO注入荷瘤鼠体内，经过不同时间(48、36、24和12 h)后再注射 68Ga-L-NETA-Tz，利用"TCO-Tz"反应(点击化学特异性结合)实现 68Ga-L-NETA-Tz与Cetuximab-TCO的体内连接；进行小动物PET显像及生物分布实验。数据比较采用单因素方差分析。 结果:成功制备 68Ga-L-NETA-Tz分子探针，标记率>95%，2 h放化纯>95%。体外细胞摄取实验证实了预定位技术的可行性：先后加入Cetuximab-TCO与 68Ga-L-NETA-Tz后，1 h时MDA-MB-468细胞摄取率可达(0.69±0.04)%。体内PET显像及生物分布实验结果示，提前36 h注射Cetuximab-TCO，MDA-MB-468荷瘤鼠有最高的肿瘤摄取值[(0.77±0.05)每克组织百分注射剂量率(%ID/g)，1 h]及最佳的靶/非靶比值(肿瘤/肌肉：4.67±0.46)；给予过量Cetuximab的阻断组、未提前注入Cetuximab-TCO组及MDA-MB-231组肿瘤未见明显摄取[(0.35±0.01)、(0.39±0.05)、(0.45±0.10) %ID/g； F＝15.50， P＝0.002]。 结论:采用预定位技术，通过先后注射Cetuximab-TCO和 68Ga-L-NETA-Tz，在荷瘤鼠模型中成功进行了靶向EGFR免疫PET显像，为单抗免疫PET显像提供了一种有效的方法。

目的:制备一种针对整合素αM(CD11b)受体的预定位分子探针 68Ga-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酸-精氨酸-谷氨酸-十一聚乙二醇-1，2，4，5-四嗪/CD11b抗体片段-反式-环辛烯[ 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz/anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO]，并通过microPET显像探讨其作为CD11b受体靶向分子探针的可行性。 方法:采用免疫荧光法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7膜表面CD11b受体的表达情况。将CD11b抗体与TCO连接，并通过酶切法得到anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO。对配体NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz进行 68Ga标记，检测标记率以及放化纯。进行预定位细胞结合实验，建立CT26结肠癌荷瘤裸鼠模型，进行预定位生物分布以及microPET显像实验。用免疫组织化学检查验证肿瘤微环境中CD11b +细胞的浸润情况。用单因素方差分析比较组间差异。 结果:免疫荧光检测结果显示RAW264.7细胞膜表面高度表达CD11b受体。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证成功合成anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO。放射性配体 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz标记率约为94.6%，比活度为7.0~7.4 MBq/μg，放化纯大于95%。预定位细胞结合实验证实该分子探针与CD11b受体有较好的靶向性。生物分布及显像结果示，在预定位4、12以及24 h时间间隔下，模型鼠肾放射性摄取较高，表明分子探针通过肾代谢；肿瘤/肌肉比值为9.23±1.45、12.53±1.36和10.74±1.11( F＝848.8， P<0.05)；在预定位12 h注射放射性配体后1 h显像，肿瘤与非靶器官对比度最佳：肿瘤标准摄取值(SUV)为0.67±0.12，肌肉SUV为0.09±0.04。免疫组织化学结果示，CT26结肠癌微环境中浸润了大量CD11b +细胞。 结论:成功合成预定位分子探针 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz/anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO，该标记物对CD11b阳性结肠癌具有较强的靶向能力，有望用于靶向CD11b受体的体内示踪。

目的:构建基于谷胱甘肽（GSH）响应共价成环的聚集诱导发光（AIE）自组装探针并进行体外评价。方法:通过固相多肽合成法制备含2-氰基-6-氨基苯并噻唑-半胱氨酸（CBT-Cys）缩合基序的多肽序列，再经点击化学反应与AIE分子偶联，构建了一种基于GSH响应共价成环的AIE自组装探针（记作探针1），同时以缺乏Cys结构的探针2为对照。测试探针的吸收和发射光谱，分析探针对GSH的特异性及响应后的粒径和结构变化，考察不同pH值、温度、探针浓度和GSH浓度对探针荧光强度的影响，并评价探针对肿瘤细胞HeLa、HepG2和MDA-MB-231的毒性。结果:经GSH响应后，探针1的荧光增强约6倍，探针2的荧光增强约2倍；探针1转化为二聚体，粒径约896.1 nm，探针2缺乏成环基序，仅转化为单体，粒径约427.4 nm。在pH值为7.0、温度为37 ℃条件下，探针1的荧光强度显著高于探针2。两种探针对肿瘤细胞HeLa、HepG2和MDA-MB-231的毒性均较低。结论:探针1分子中的二硫键经GSH还原后，分子因失去亲水序列导致荧光开启（第1次聚集），并因含有CBT-Cys成环基序随即生成AIE二聚体（第2次聚集）。与探针2单次聚集相比，探针1实现了双重AIE效应，显著增强了荧光强度，并在生理环境下具有较好的适用性，为体内原位生成共价成环探针提供了思路，后期有望用于体内肿瘤成像与治疗。

目的 探讨两种代谢法荧光探针对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)的影响,并比较两种荧光探针标记的Pg在小动物活体成像中的应用效果.方法 本研究通过单位伦理委员会审查及单位实验生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准.Pg通过生物正交反应整合四酰化N-叠氮基乙酰半乳糖胺(N-azidoacetylgalactosamine,Ac4GalNAz),再通过点击化学反应实现了Cy5-二苯并环辛炔(Cy5-Dibenzocy-clooctyne,Cy5-DBCO)、Cy7-DBCO标记.根据细菌不同标记状态进行分组:Pg组(对照,未经荧光标记的Pg)、Cy5-Pg组(Cy5-DBCO标记的Pg)、Cy7-Pg组(Cy7-DBCO标记的Pg).细菌活死染色试剂盒检测Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg的活性;Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg分别刺激人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)后检测HGF白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8的mRNA水平和HGF增殖能力;与大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)共培养检测荧光标记的Pg的稳定性;用小动物活体成像系统(in vivo imaging system,IVIS)检测系列浓度梯度的Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度.最后,将Cy5-Pg、Cy7-Pg分别经口灌饲给C57BL/6J小鼠,IVIS分别检测Cy5或Cy7信号强度,计算信噪比.结果 代谢法可以被应用于活的Pg的荧光标记,Cy5、Cy7标记Pg的最佳浓度分别为20 μmol/L、30 μmol/L.Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg中活死细菌所占面积比值分别为1.86、1.85、1.88(F=0.318,P＞0.05).Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg刺激HGF 6 h后,HGF的IL-6、IL-8 mRNA水平分别比Ctrl组(无细菌刺激组)升高了7.86、7.46、6.56倍(IL-6,F=40.886,P＜0.001)和12.43、13.03、13.71倍(IL-8,F=18.781,P＜0.01),3个实验组间无明显差异(P＞0.05).Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg以不同MOI(multiplicity of infection)刺激HGF,与Ctrl组(无细菌刺激组)相比,HGF的增殖能力均显著下降(MOI=104∶1,F=153.52,P＜0.001;MOI=105∶1,F=331.21,P＜0.001;MOI=106∶1,F=533.65,P＜0.001),3个实验组间差异无统计学意义(P＞0.05).Cy5-Pg或Cy7-Pg与E.coli共培养的24 h内,仅有非常少的E.coli被标记上荧光,且3 h内荧光强度几乎无衰减.Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度与浓度呈正线性相关(R2=0.97).Cy5-Pg或Cy7-Pg灌饲至小鼠体内后,在1 h、3 h时,Cy7-Pg在小鼠腹部成像的信噪比分别为Cy5-Pg的4.24倍(t=6.893,P＜0.01)、3.77倍(t=4.407,P＜0.05);Cy7-Pg在分离出的胃肠道内成像的信噪比为Cy5-Pg的5.19倍(t=4.418,P＜0.05).结论 代谢法荧光标记不影响Pg的活性、免疫调节能力和毒性.在小动物活体成像中Cy7具有比Cy5更好的成像效果,为研究牙周炎和全身疾病的联系提供了实验基础.

目的·构建一种基于透明质酸(hyaluronic acid.HA)的自愈合可注射性水凝胶,探究不同浓度铜离子对水凝胶性能及其促成血管功效的影响,评估其应用于临床上伤口愈合的可行性.方法·在光引发剂2959的存在下,通过蓝光诱发了巯基化透明质酸(thiolated hyaluronic acid,HASH)和丙烯酸化双膦酸盐(acrylated bisphosphonate,Ac-PD)之间的巯基-烯点击反应,制备了双膦酸盐化透明质酸(bisphosphonated hyaluronic acid,HAPD);基于HAPD和Cu2+的金属配位作用,构建了不同Cu2+浓度的HAPD-Cu水凝胶,即HAPD-Cul、HAPD-Cu2、HAPD-Cu3以及HAPD-Cu4.采用核磁氢谱以及傅里叶红外光谱验证HASH、Ac-PD、HAPD和HAPD-Cu的分子结构;采用扫描电镜观察HAPD-Cu的微观形貌;采用流变仪验证HAPD-Cu的剪切变稀和自修复特性;采用液相质谱仪测定HAPD-Cu的离子释放;通过活/死细胞染色和CCK-8评价HAPD-Cu的生物相容性;通过人脐静脉血管内皮细胞的成小管实验测定HAPD-Cu的体外促成血管活性;通过CD31组织染色评估HAPD-Cu的体内促成血管活性并建立体外大鼠伤口缺陷模型评价其实际修复效果.结果·化学定性和定量分析手段证明材料的成功制备;体外研究表明,HAPD-Cu均具有疏松多孔的内部结构,且具有优异的自愈性、可注射性和可降解性,降解周期为7d并具有突释行为,满足伤口愈合周期的需求;HAPD-Cu具有良好的生物相容性,但HAPD-Cu4因Cu2+浓度高而具有细胞毒性.此外,在允许的Cu2+浓度范围内,其体外或体内的成血管效果随着Cu2+浓度的增加而增强;且体外伤口模型实验表明,与对照组相比,HAPD-Cu水凝胶显著促进了伤口的愈合.结论·基于金属配位制备的HAPD-Cu水凝胶具有优异的形状可塑性,允许以微创的形式填充缺陷部位,并释放Cu2+以促进早期血管网络的建立,在用于临床上不规则的伤口修复方面具有良好的应用潜力.

2023年10月31日,浙江大学药学院、金华研究院、先进药物递释系统全国重点实验室顾臻教授、俞计成研究员和王金强研究员在《自然·通讯》(Nature Communications)发表了最新研究成果论文"An in situ dual-anchoring strategy for enhanced immobilization of PD-L1 to treat autoimmune diseases"(DOI:10.1038/s41467-023-42725-1).该研究开发了一种"双锚定"细胞表面工程化策略,通过结合点击化学和物理插膜技术延长免疫检查点抑制剂蛋白程序性死亡配体-1 (PD-L1)在目标细胞如胰岛β细胞和软骨细胞膜表面保留时长,从而抑制T淋巴细胞活性.研究结果验证了在动物模型中该策略可有效缓解自身免疫性疾病如I型糖尿病和类风湿性关节炎的发病率和症状.

目的 探讨基于偏氟乙烯(vinylidene fluoride,VDF)和三氟乙烯(trifluoroethylene,TrFE)的共聚物[poly(VDF-TrFE),P(VDF-TrFE)]构建的复合压电纳米粒子在脑胶质瘤细胞中治疗和成像的效能.方法 对P(VDF-TrFE)压电材料进行晶型重塑和亲水性改善,通过点击化学反应将精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸合成肽(Arg-Gly-Asp,RGD)连接到二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺脂[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(ethylene glycol)-maleimide,DSPE-PEG-Mal]上;同时以DSPE-PEG-四氮杂环配体(DSPE-PEG-tetranitroheterocyclic ligand,DSPE-PEG-DOTA)为底液,加入一定量醋酸钆溶液,通过螯合获得 DSPE-PEG-DOTA-钆造影剂(DSPE-PEG-DOTA-Gd);按比例将重塑后的 P(VDF-TrFE)、DAPE-PEG-Mal-RGD 和DSPE-PEG-DOTA-Gd混合,最后获得复合压电纳米粒子P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD,对其进行表征以及用于细胞层面实验研究.结果 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子具有优异的稳定性,尤其是在达尔伯克氏必需基本培养基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)中,其粒径随时间变化保持在 160 nm左右;经过晶型重塑后,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的压电性能明显提高,表面电势约为 4.2 mV;该纳米粒子可作为磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)显像剂,而且在超声激发下,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子能产生大量活性氧,抑制了胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力,同时还促进其凋亡.结论 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子作为MRI显像剂可以用于脑胶质瘤的定位,且可以作为一种声敏剂用于脑胶质瘤细胞的声动力治疗.

目的 制备新型口服骨靶向微/纳水凝胶微球,并了解其对雌性去势小鼠骨质量的影响.方法 以多面体低聚倍半硅氧烷作为纳米平台,通过点击化学合成具有骨靶向性能的纳米颗粒,然后基于气体微流控和离子交联技术制备新型口服骨靶向微/纳水凝胶微球.采用活/死细胞染色评估微/纳水凝胶微球的生物相容性.选用 18 只 8 周龄雌性C57BL/6 小鼠,随机分为去卵巢组(A组)、空白水凝胶微球组(B组)和微/纳水凝胶微球组(C组),每组 6 只.各组连续干预 8 周后收集小鼠股骨标本,采用微型计算机断层扫描(Micro-CT)分析骨小梁参数,利用三点弯曲测试评估股骨生物力学性能.结果 骨靶向纳米颗粒具有均匀的球形形貌,平均粒径为40.6 nm;微/纳水凝胶微球呈球形形貌,表面粗糙,平均粒径为250.8 μm;活/死细胞染色结果提示微/纳水凝胶微球具有良好的生物相容性.Micro-CT显示,C组小鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁数目均显著高于A组和B组小鼠,差异有统计学意义(P＜0.05),C组小鼠的骨小梁间隙显著低于A组和B组小鼠,差异有统计学意义(P＜0.05).三点弯曲测试显示,C组小鼠的最大载荷和断裂能显著高于A组和B组小鼠,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 新型口服骨靶向微/纳水凝胶微球具有良好的生物相容性,其负载的骨靶向纳米颗粒显著提高雌性去势小鼠骨质量,为绝经后骨质疏松症治疗提供了新的策略.

目的 探究生物正交点击化学修饰可否用于脂肪间充质干细胞(ADSC)的吲哚菁绿(ICG)标记及活体示踪研究.方法 收集小鼠脂肪组织进行ADSC的分离与培养,分别添加Ac4ManNAz、DBCO-ICG进行生物正交点击化学反应,评估该方法对ADSC细胞活性的影响,并利用共聚焦显微镜观察ADSC的ICG标记情况;将标记ICG的ADSC移植到急性肝损伤小鼠体内,利用近红外二区荧光成像开展ADSC的活体示踪研究,收集肝组织进行ADSC归巢性分析;最后,评估生物正交点击化学修饰对ADSC移植治疗急性肝损伤疗效的影响.结果 生物正交点击化学可将ICG探针成功地修饰于ADSC细胞内,且不影响ADSC的细胞活性;标记ICG的ADSC移植到体内后主要分布、定位在肝组织内,说明ADSC具有肝向归巢性;生物正交点击化学修饰不影响ADSC改善急性肝损伤小鼠肝功能、减少肝细胞坏死的疗效.结论 生物正交点击化学可用于ADSC的ICG探针标记及活体示踪研究.

在免疫分析和生物芯片中,抗原-抗体特异性结合被广泛应用,其中抗体的固定化是研发高效诊断和分离工具的关键环节.生物分子工程、材料化学与交联剂化学的进步极大地促进了抗体固定化技术的发展.抗体可以通过物理吸附、共价偶联和亲和相互作用固定到不同类型的固相表面.抗体固定化的目标是以一种正确的空间取向将抗体固定到固相表面,在完全保留抗体构象和活性的同时最大化抗原的结合能力,这对固相化抗体的分析性能至关重要.对固定抗体到固相载体表面的各种最新方法进行了阐述,包括物理吸附法,通过羧基、氨基、巯基、糖基和点击化学的共价结合法以及基于生物亲和作用的固定法,并对固定化抗体的表征方法进行了归纳,最后对抗体固定化方法的发展方向进行了展望.