探究珠子参总皂苷对人宫颈癌细胞系HeLa增殖、凋亡和自噬的影响.利用紫外-可见分光光度计检测珠子参总皂苷中皂苷的含量;分别运用CCK-8、DAPI染色法及流式细胞术检测珠子参总皂苷对HeLa细胞活力、细胞核形态变化、细胞周期与凋亡的影响;Western blot技术检测HeLa细胞中凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的半胱氨酸蛋白酶蛋白-9(cleaved caspase-9)、活化的半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(cleaved caspase-3),自噬相关蛋白苄氯素1(Beclin-1)和SQSTM1(p62),磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白表达的影响.研究发现,珠子参总皂苷的得出率、皂苷质量分数分别为6.3％、78.3％;珠子参总皂苷可显著抑制HeLa细胞的增殖(P＜0.001),影响HeLa细胞核形态,阻滞HeLa细胞G0/G1期周期,诱导细胞凋亡,且呈现一定的浓度依赖性.进一步发现珠子参总皂苷可上调促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3和自噬相关蛋白p62的表达(P＜0.05),下调抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬相关蛋白Beclin-1的表达(P＜0.01),促进p-p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK,简称 p38)/p38、p-c-Jun 氨基末端激酶(JNK)/JNK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 水平(P＜0.05),对p-ERK/ERK影响不显著.结果表明,珠子参总皂苷可能通过激活PI3K/Akt/mTOR、JNK和p38信号通路,抑制HeLa细胞自噬,促进其细胞凋亡,表明了珠子参可能具有抗宫颈癌的潜在作用.

珠子参叶是五加科(Araliaca)植物珠子参(Panax japonicas var.major)的干燥带梗叶,为秦巴地区特色中药材.为合理开发利用珠子参叶并阐明其化学成分,该研究利用HPLC方法分析珠子参叶皂苷部位的主要化学成分,测定珠子参叶皂苷部位的脂肪酶抑制活性及抑制类型,通过分子对接及动物实验验证脂肪酶抑制机制及降血脂作用.结果表明:(1)珠子参叶皂苷部位主要成分为20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rh2.(2)珠子参叶皂苷部位、20(R)-人参皂苷 Rg2对脂肪酶具有较强的抑制作用,其IC50分别为 0.14、2.30 μmol·L-1.(3)珠子参叶皂苷部位、20(R)-人参皂苷Rg2、人参皂苷 Rb3 对脂肪酶的抑制为可逆性抑制,抑制类型为非竞争型抑制.(4)配体与ARG337B、ASP331B、ILE248B残基结合可能有助于提高配体的脂肪酶抑制活性.(5)珠子参叶总皂苷可以显著降低高脂血症小鼠血清中胆固醇和甘油三酯的含量.该研究为珠子参叶在降血脂方面的深入开发和利用提供了理论参考.

研究珠子参总皂苷(total saponins of Panax japonicus,TSPJ)对对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导小鼠肝损伤的影响及作用机制.将雄性昆明小鼠随机分为空白组、TSPJ组(200 mg·kg-1,ig)、模型组、APAP+TSPJ低剂量组(50 mg·kg-1,ig)、APAP+TSPJ中剂量组(100 mg·kg-1,ig)、APAP+TSPJ高剂量组(200 mg·kg-1,ig)和APAP+N-乙酰半胱氨酸组(200 mg·kg-1,ip).给药组每天ig或ip相应的药物,每天1 次,连续14 d.末次给药1 h后,除空白组和TSPJ组外,各组小鼠均灌胃给予 500 mg·kg-1 APAP,24 h 后收集小鼠血清与肝脏组织进行血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotrans-ferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、环氧合酶(cyclooxygenase,COX)-2、IL-6、IL-4、IL-10 及肝组织中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的水平,苏木精-伊红染色观察肝组织形态学改变;实时定量PCR法测定肝组织中淋巴细胞抗原 6G(lymphocyte antigen 6G,Ly6G)、半乳糖凝集素 3(galectin 3,Mac-2)、TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-6、IL-4、IL-10 mRNA表达,Western blot法测定肝组织中Ly6G、Mac-2、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinase,p-ERK)、COX-2、核因子κB抑制因子α(inhibitor of nu-clear factor κB protein α,IκBα)、磷酸化核因子 κB 抑制因子 α(phosphorylated inhibitor of nuclear factor κB protein α,p-IκBα)、胞浆和胞核中核因子κB亚基p65(nuclear factor κB subunit p65,NF-κB p65)蛋白表达.结果显示,TSPJ可显著降低APAP诱导小鼠肝脏系数、血清中ALT、AST、ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 水平及肝组织LDH、MPO、MDA水平和肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达,升高血清中IL-4、IL-10 含量及肝组织中GSH、CAT、SOD、T-AOC水平和肝组织中IL-4、IL-10 mRNA表达;改善肝脏病理损伤程度,抑制肝组织中性粒细胞浸润和巨噬细胞募集;降低肝组织中中性粒细胞标记物Ly6G、巨噬细胞标记物Mac-2 和COX-2 mRNA和蛋白表达,降低p-ERK、p-IκBα、胞核NF-κB p65 蛋白表达和p-ERK/ERK、p-IκBα/IκBα比率,升高胞浆NF-κB p65 蛋白表达.以上结果表明,TSPJ对APAP诱导的小鼠肝损伤有显著保护作用、可减轻APAP引起的氧化损伤与炎症反应,其作用机制与抑制ERK/NF-κB/COX-2 信号通路激活,进而抑制炎性细胞浸润、炎症因子生成和抑制肝细胞损伤密切相关.

目的 建立珠子参药材中皂苷类成分HPLC特征图谱,为其质量控制提供依据.方法 采用HPLC法测定珠子参药材中皂苷类成分,色谱柱为Agilent Poroshell 120 C18(4.6 mm×100 mm,2.7μm),乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 ml/min,检测波长为203 nm,柱温为35℃.结果 通过对8批次珠子参药材中皂苷类成分HPLC特征图谱的研究,确定了14个共有峰,对照品比对指认了其中4个皂苷类成分,分别为人参皂苷Rb1、Ro、竹节参皂苷Ⅳa、人参皂苷Rd;8批珠子参药材中有7批相似度大于0.90.结论 该方法精密度高、重复性强、稳定性好,可用于珠子参药材的质量控制.

该研究以珠子参愈伤组织为材料,通过同源克隆方法获得了珠子参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因(PjHMGR,登录号:MG712296)的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析.基于PjHMGR序列构建了珠子参过表达载体pCAMBIA2300s-PjH MGR,通过根瘤农杆菌转化法将其转化到珠子参细胞中,成功获得7株阳性转PjHMGR基因细胞系;通过实时荧光定量PCR、比色法及皂化法等技术测定阳性细胞系PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活、皂苷和植物甾醇含量变化.结果显示:(1)与野生型珠子参细胞系相比,转PjHMGR基因珠子参阳性细胞系中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量均有不同程度的提高;在效果最好的阳性细胞中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量分别为对照的7.15、6.14和3.50倍.(2)在研究过程中,发现转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高.研究认为,将珠子参关键酶基因PjHMGR过表达载体导入珠子参愈伤组织细胞中,可引起相关关键酶基因相对表达量和PjHMGR酶活性的增加,从而调控珠子参总皂苷的合成,对皂苷合成途径中关键酶基因进行调控将可能实现对皂苷生物合成的调节.

珠子参作为名贵中草药已有上千年应用历史,珠子参皂苷是珠子参的主要活性成分,由达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷组成.目前,对珠子参皂苷的生物合成了解甚少,有必要开展与皂苷合成相关的基础研究工作.已有报道表明,法尼基焦磷酸合酶(FPS)可能是植物中皂苷合成的关键酶.本研究克隆了珠子参FPS基因(PjFPS)的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析.基于PjFPS序列构建了珠子参过表达载体pCAM-BIA2300s-PjFPS,将其转化到珠子参细胞中,成功获得阳性转基因细胞;测定了阳性细胞系中PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷以及植物甾醇含量的变化.结果表明,与野生型珠子参细胞相比,PjFPS转基因珠子参细胞系中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活以及皂苷含量均有不同程度的提高.而且,由于皂苷合成代谢流的增加,也促进了相关重要关键酶基因的表达.在效果最好的阳性细胞中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷含量分别为对照的12、4和3倍;同时,转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高.本研究通过对皂苷合成途径关键酶基因的调控实现了对皂苷生物合成的调节,为获得高效、稳定的珠子参皂苷合成调控技术提供理论参考和依据.

为研究不同遮阴处理下皂苷合成关键酶表达对珠子参总皂苷合成与积累的影响,以全光照、30％遮阴和50％遮阴3种处理下的盆栽珠子参为材料,分别用实时荧光定量PCR法和紫外分光光度法测定了不同生长时期珠子参叶和根茎中3个关键酶基因(CAS,DS,β-AS)的表达和总皂苷含量.结果表明,在开花期CAS,DS,β-AS均在珠子参地上部分高表达,30％遮阴处理显著抑制了叶中CAS的表达而促进了茎,叶和花中DS,β-AS的表达,推测在此时期皂苷合成的主要部位为叶.整个生长周期内,DS,β-AS的表达与叶中总皂苷含量的变化均呈现出“低—高—低”的趋势,相关系数分析表明,两者之间为正相关关系.遮阴处理下DS,β-AS的总体表达水平和总皂苷含量远高于全光照处理,其中以30％遮阴处理对总皂苷积累的促进作用最明显.因此建议在人工栽培珠子参时,采取30％的遮阴处理,以利于珠子参皂苷的积累和品质的提升.

目的:研究酸枣仁芽的化学成分,从物质基础的角度探寻萌发对酸枣仁活性的影响.方法:将干燥的酸枣仁芽粉碎后石油醚浸泡提取,除去油脂类成分,残渣干燥后再用甲醇加热回流提取,减压浓缩后得酸枣仁芽甲醇浸膏,将浸膏溶解,采用硅胶,C18反相硅胶,LH-20型羟丙基葡聚糖凝胶等多种柱色谱方法进行分离纯化,并利用NMR和MS等现代波谱技术,结合参考文献确定化合物的化学结构.结果:从酸枣仁芽中分离鉴定13个化合物,分别为酸枣仁皂苷B(1),酸枣仁皂苷D(2),酸枣仁皂苷A(3),白桦脂酸(4),白桦脂醇(5),羽扇豆醇(6),麦珠子酸(7),美洲茶酸(8),齐墩果酸(9),熊果酸(10),木兰花碱(11),荷叶碱(12),当药黄素(13).结论:以上化合物均首次从酸枣仁芽中分离得到.经对比,发现酸枣仁芽的化学成分与传统药用部位种子相似,主要为三萜及皂苷类、黄酮类、生物碱类化合物等,为酸枣仁芽药用资源的开发利用提供了一定的化学依据.

目的 分析不同功效的6种人参属药材提取物的体外凝抗血活性差异.方法 采用凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)实验,探讨6种人参属药材提取物抗凝血活性的差异性;分析其抗凝血活性与皂苷含量的相关性.结果 竹节参、珠子参及三七可显著延长PT、APTT,降低FIB水平,呈现明显的量效关系;而人参、西洋参及屏边三七无显著变化.竹节参、珠子参提取物的抗凝血活性明显强于三七提取物.6种人参属药材中人参皂苷含量与其抗凝血活性的相关性分析表明,PT与人参皂苷Rb2含量呈现显著的正相关;且人参皂苷Rb2可显著延长PT、APTT.结论 6种人参属药材抗凝血活性存在差异,且抗凝血活性与人参皂苷Rb2含量相关.

目的:研究珠子参根状茎中不同部分的皂苷组成.方法:利用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和HPLC法,分析根状茎中皂苷组成和含量差异.结果:珠子参根状茎的“膨大”和“细长”两个部分的皂苷种类不同,且含量存在显著差异.根状茎细长部分含有17种皂苷,而膨大部分仅含有其中的7种.HPLC结果表明,膨大部分中皂苷含量以齐墩果烷型皂苷(如竹节参皂苷Ⅳ和竹节参皂苷Ⅳa)为主;细长部分中含量以达玛烷型皂苷(如人参皂苷Rd和人参皂苷Malonyl-Rd)为主.结论:对珠子参根状茎两部分皂苷组成和含量差异等研究,可以为探讨两个部分的基因表达及人参属植物根状茎膨大相关基因的发现奠定物质基础.建立的HPLC方法可为珠子参药材质量控制提供参考.