目的 探索经典名方泽泻汤对高脂血症模型小鼠的调脂作用机制.方法 采用ELISA法检测血清中血脂四项、肝功能指标及胆固醇脂酰转移酶(LCAT)水平.采用HE和油红O染色法判断肝组织病理情况.采用网络药理学预测泽泻汤降脂相关靶点,实现对交集靶点GO功能和KEGG通路富集分析.采用PCR芯片技术检测网络药理学筛选的目的基因,应用qPCR和Western blot检测基因和蛋白表达量.结果 泽泻汤可显著调节高脂血症模型小鼠的血脂四项水平,改善因高脂引起的肝损伤指标升高,对肝脏组织中脂质代谢关键酶HMGR、CYP7A1 及脂质转运体ABCA1、Apo-A1 具有反向调节作用.HE和油红O染色显示,泽泻汤可改善肝组织病理形态,减轻肝组织的脂质沉积情况,阳性面积比率显著下降(P<0.01).PCR芯片获取反向调节基因 44 个,GO功能富集分析获取了 266 个条目,KEGG通路富集分析筛选得到 99 条信号通路.qPCR及Western blot结果显示,泽泻汤组显著下调PIK3CG、AKT1、IL-6 基因表达量(P<0.05,P<0.01),上调ABCG1 基因表达量(P<0.05),下调PI3 Kinase p110β、p-AKT(Ser473)及SREBP-1c蛋白表达水平(P<0.01);泽泻汤能够反向调节miR21-5p(P<0.01).结论 泽泻汤对高脂血症模型小鼠脂代谢具有显著的调节作用,能改善高脂血症引起的肝损伤,其调脂作用可能与调节胆固醇在体内代谢、转运有关,与miR21/PI3K-Akt/SREBP通路密切相关,且泽泻汤全方调脂效果优于单味药.

该研究以"裂叶""狭长叶""卵圆叶"及"大圆叶"4种不同叶型北苍术为试验材料,建立北苍术根茎中苍术素、白术内酯Ⅰ、β-桉叶醇和苍术酮4种成分同时测定的方法;利用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)和法呢基焦磷酸合酶(FPPS)3种生物合成关键酶基因的表达量,采用HPLC比较不同叶型北苍术中4种有效成分含量差异,并探讨有效成分含量与生物合成关键酶基因表达量二者的相关性.结果表明,苍术素、白术内酯 Ⅰ、β-桉叶醇和苍术酮分别在 3.30～33.00 μg·mL-1(r=0.999 7),12.04～120.40 μg·mL-1(r=0.999 5),29.16～291.60 μg·mL-1(r=0.999 5),14.20～142.00 μg·mL-1(r=0.999 5)呈良好的线性关系,其平均回收率分别为99.77％(RSD=2.1％),98.56％(RSD=1.2％),103.0％(RSD=1.2％),100.6％(RSD=1.5％),该方法结果准确,重复性好,可用于苍术素、白术内酯Ⅰ、β-桉叶醇和苍术酮含量的同时测定.该研究结果表明,不同叶型北苍术中4种有效成分含量差异明显,裂叶苍术中苍术素、白术内酯Ⅰ、β-桉叶醇含量均最高,质量分数分别为1.341 9、5.237 2、12.084 3 mg·g-1;狭长叶苍术中苍术酮质量分数最高(5.470 1 mg·g-1);卵圆叶苍术中苍术素、白术内酯Ⅰ、β-桉叶醇和苍术酮含量均最低.4种有效成分总量由高到低依次为裂叶苍术＞狭长叶苍术＞大圆叶苍术＞卵圆叶苍术.裂叶苍术中关键酶ACC、HMGR、FPPS基因表达量最高(P＜0.05),卵圆叶苍术关键酶ACC、HMGR基因表达量最低(P＜0.05),大圆叶苍术关键酶FPPS基因表达量最低.不同叶型北苍术中,关键酶基因ACC与聚乙炔类成分苍术素呈极显著正相关(P＜0.01),关键酶基因HMGR、FPPS与倍半萜类成分白术内酯Ⅰ、β-桉叶醇和苍术酮均呈正相关关系.综上,不同叶型中裂叶北苍术品质最佳,且其药效成分苍术素的生物合成与关键酶ACC基因表达显著相关,这为筛选和优化北苍术种质资源,提高药材品质提供理论依据.

近年来,灵芝产业高速发展,但其主要药效成分灵芝三萜的含量较低,是影响其品质的重要原因,因此探索一种提高灵芝三萜含量的生物技术手段极具应用前景.本研究以 6 株斜盖伞Clitopilus spp.真菌为材料分别制备多种类型的真菌诱导子,将其添加到灵芝菌丝体液体摇瓶中,研究对灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜积累的影响.其中,Clitopilus sp.HSL-YX-7-A 的高压灭菌发酵液(HSL FB)、C.hobsonii NL-19 的菌丝干粉(NL-19 DMP)、C.prunulus 84496 的发酵液提取物(84496 FBE)和Clitopilus sp.HSL-YX-7-A的菌丝提取物(HSL ME)显著提高了灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜含量,相对于对照组,生物量分别提高了 450.09%、64.64%、46.97%和 66.14%,灵芝三萜分别提高了 53.01%、25.58%、25.17%和 20.47%,灵芝三萜总产量则分别提高了 585.15%、104.65%、86.43%和110.45%.进一步研究表明,经HSL FB、NL-19 DMP和HSL ME处理后,灵芝三萜生物合成途径关键酶基因hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs和osc的表达量显著上调;但84496 FBE处理之后仅上调了hmgs和sqs的表达量.且6个基因的平均表达量与灵芝三萜总产量的提升率呈显著的正相关性(R2=0.972,P<0.05).本研究证实了斜盖伞诱导子能够有效提升灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜含量,其中C.hobsonii NL-19 和Clitopilus sp.HSL-YX-7-A均为栎类树种的根系共生菌.本研究进一步为开发斜盖伞真菌作为微生物菌剂提供了基础,同时为提高栎树人工林的生产力和创建"以菌养菌"的药用真菌品质提升技术体系提供了重要策略.

为探讨西洋参不定根对干旱胁迫的应答机制及外源水杨酸(SA)对西洋参不定根抗旱性的影响,本研究使用质量分数为10％的PEG-6000模拟干旱胁迫预处理,然后添加不同浓度(0,10,40,80 μmol/L)的外源SA,分别在处理2、4、6、8 d时检测西洋参不定根中抗氧化酶活性、渗透调节物质含量以及药用成分总黄酮、总皂苷、单体皂苷Rb1和Re的积累量,并检测人参皂苷生物合成途径中相关合成和调控基因的表达量.结果显示:(1)西洋参不定根中过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性以及游离脯氨酸含量均在80 μmol/L SA处理4 d时出现峰值,而丙二醛(MDA)含量在40 μmol/LSA处理4 d时达到峰值.(2)西洋参不定根中总黄酮的含量在80 μmol/L SA处理6 d时达到最大值,总皂苷和单体皂苷Re含量在40 μmol/L SA处理8 d时达到最大值,单体皂苷Rb1含量在40 μmol/L的SA处理6 d时达到最大值.(3)Pq-HMGR和Pq-DS基因表达量在40 μmol/L SA处理2 d时提高了 3 倍以上,Pq-CYP6H、Pq-D12H、Pq-3-O-UGT1 和 Pq-bHLH25 基因表达量在 40 μmol/L SA 处理后提高了 1倍以上.研究表明,适宜浓度的外源SA可以有效改善西洋参不定根在干旱胁迫环境下的生理生化指标,提高相关基因的表达量,从而提高其抗旱能力和药用成分含量.

目的 克隆金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)基因,并进行生物信息学及接茵前后差异表达分析.方法 采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得DnHMGR2基因cDNA全长;生物信息学分析编码蛋白的理化特性、结构域等特征;用DNASTAR、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建分析;借助实时定量PCR技术检测基因接菌前后表达模式.结果 从金钗石斛中分离得到一个HMGR基因,命名为DnHM GR2(GenBank注册号KX825920).DnHMGR2基因cDNA全长2 095 bp,编码一条由562个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为59.68×103,等电点6.18.DnHM GR2蛋白具有植物HMGR酶的典型结构域和结合基序.DnHMGR2与多种植物HMGR基因高度同源,与铁皮石斛的亲缘关系最近.DnHM GR2基因具有组织表达特异性,在金钗石斛叶、茎中的表达量较高,为根中的2.59和1.60倍;但接菌后各器官的表达量表现为茎＞叶＞根.结论 首次克隆得到金钗石斛中HMGR基因的全长cDNA,为进一步解析该基因在金钗石斛萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用,及茵根真菌对石斛碱生物合成调控机制奠定了基础.

目的:探讨依折麦布和考来替泊交替给药对于高脂血症大鼠的脂代谢调节作用.方法:选用清洁级的SD大鼠50只,雌雄各半,通过高脂饲料饲养造模,造模成功后随机分组,设置正常组、模型组、实验组(依折麦布组、考来替泊组、依折麦布+考来替泊组),实验组每日灌胃给药,正常组和模型组给予生理盐水,连续给药8周,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量以及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合酶(FAS)、3-羟基-3-甲基戊酰辅酶A还原酶(HMGR)、肝脏肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPT-Ⅰ)的mRNA的表达.结果:实验组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量以及ACC、FAS、HMGR、CPT-Ⅰ的mRNA表达相比模型组均有降低且交替用药组较单一用药组含量显著降低(P＜0.05).结论:依折麦布和考来替泊交替给药对于高脂血症大鼠脂代谢的调节优于单一用药,但是对人体的作用还需要临床验证.

目的:探究芥子碱硫氰酸盐(sinapine thiocyanate,ST)抑制胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)小鼠血脂血糖升高、动脉粥样硬化及肝细胞脂肪变性的机制.方法:ApoE-/-雄性小鼠60只随机分成对照组、生理盐水组、罗格列酮组和ST低、中、高剂量治疗组,每组10只.除对照组常规饲料喂养外,其余各组以高脂饲料饲养12周,ST低、中、高剂量组同时给予ST(10、30和90 mg·kg-1·d-1)灌胃,罗格列酮组给予罗格列酮(1.33 mg·kg-1·d-1)灌胃.最后3周,除对照组腹腔注射生理盐水外,其余各组腹腔注射地塞米松(0.8 mg·kg-1·d-1)诱导IR.每周断尾采血检测空腹血糖水平,第12周末禁食12 h后处死动物取样,检测空腹胰岛素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、甘油三酯、总胆固醇及肝脂质等水平;将肝组织和主动脉固定包埋切片,HE染色.Western blot测定肝脂质代谢与骨骼肌MAPK信号通路相关蛋白表达.结果:ST呈剂量依赖性降低血脂、血糖及TNF-α等代谢相关指标的水平(P<0.05),延缓肝细胞脂肪变性和动脉粥样硬化;并呈剂量依赖性调控肝脂质代谢信号通路(HMGR和SREBP-2等)及MAPK信号通路(ERK和p38等)蛋白表达(P<0.05).结论:ST抑制IR模型小鼠血脂血糖升高、动脉粥样硬化及肝细胞脂肪变性的机制可能与调控肝脂质代谢和骨骼肌MAPK信号通路相关蛋白表达有关.

为研究牛樟芝(Antrodia camphorata)萜类生物合成MVA途径中关键酶3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)的调控机制,从牛樟芝基因组中分离并克隆出AcHMGR基因,对其进行生物信息学分析、不同碳氮源添加物对该基因的诱导表达情况进行分析.分析显示:AcHMGR基因含7个外显子、6个内含子;开放阅读框为3 402 bp,编码1 133个氨基酸残基组成蛋白质序列;AcHMGR包含HMGR典型的多肽位点,即2个HMG-CoA结合基序:PLG (I/V) AGPLK (I/V) DG和AEGTLVASTSRG,2个NADP结合基序:TGDAMGMNMI和IEVGT (I/V) GGGT;分子系统进化分析显示,AcHMGR蛋白序列与其他多孔菌科真菌的HMGR聚为一支;表达谱分析显示:碳源中的果糖、氮源中的酪蛋白胨诱导表达AcHMGR基因的能力最强.本研究为探讨牛樟芝萜类,尤其是三萜类化合物的生物合成及调控机理提供了帮助.

该研究以珠子参愈伤组织为材料,通过同源克隆方法获得了珠子参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因(PjHMGR,登录号:MG712296)的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析.基于PjHMGR序列构建了珠子参过表达载体pCAMBIA2300s-PjH MGR,通过根瘤农杆菌转化法将其转化到珠子参细胞中,成功获得7株阳性转PjHMGR基因细胞系;通过实时荧光定量PCR、比色法及皂化法等技术测定阳性细胞系PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活、皂苷和植物甾醇含量变化.结果显示:(1)与野生型珠子参细胞系相比,转PjHMGR基因珠子参阳性细胞系中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量均有不同程度的提高;在效果最好的阳性细胞中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量分别为对照的7.15、6.14和3.50倍.(2)在研究过程中,发现转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高.研究认为,将珠子参关键酶基因PjHMGR过表达载体导入珠子参愈伤组织细胞中,可引起相关关键酶基因相对表达量和PjHMGR酶活性的增加,从而调控珠子参总皂苷的合成,对皂苷合成途径中关键酶基因进行调控将可能实现对皂苷生物合成的调节.

目的 克隆浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.肌动蛋白(Actin)基因,并进行生物信息学分析.方法 提取浙贝母根、茎、叶、花、鳞茎总RNA,设计合成简并引物.以叶片总RNA为模板,通过RT-PCR和Ta克隆技术克隆Actin基因保守区序列片段.以该基因为内参基因,对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因进行组织特异性表达分析.结果 经RT-PCR扩增和Ta克隆,得到1段基因序列(463 bp).浙贝母Actin基因与岷江百合、郁金香、虎眼万年青、铁皮石斛、柿子、光皮桦、玉米相似度较高(84％～98％),其氨基酸序列与阿帝露茅膏菜、甘蓝型油菜、香草兰、岷江百合、麻疯树、枸杞、红海榄的同源性均在89％以上,并且其Actin蛋白与百脉根、岷江百合、郁金香亲缘关系较近.HMGR基因在该植物各部位表达有显著差异,依次为鳞茎＞花＞叶＞茎＞根.结论 首次从浙贝母中克隆出Actin基因(命名为FtActin),可为其有效利用奠定基础.