目的:探讨LIN28同源物A的信使RNA(LIN28A mRNA)作为非编码RNA在结肠癌发展中的功能及其机制。方法:在结肠癌细胞株HCT116和SW1116中分别构建非编码功能的LIN28A mRNA过表达和LIN28A蛋白过表达细胞系，并用荧光定量聚合酶链发应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)进行验证。细胞计数试剂盒(MTT)检测细胞增殖能力，细胞侵袭实验(Transwell)实验分析细胞迁移和侵袭能力。质谱检测过表达非编码功能的LIN28A mRNA导致的蛋白变化，并通过生物信息学方法筛选其功能性靶分子，Western blot法验证LIN28A mRNA对其表达的影响。构建其靶分子敲低的结肠癌细胞系，通过Transwell实验检测其靶分子在结肠癌中发挥的功能。组间数据比较采用 t检验。 结果:无编码功能的LIN28A mRNA组细胞转移能力明显高于对照组，差异有统计学意义(HCT116迁移：1.065±0.323比2.768±0.249， t＝8.345， P<0.05；SW1116迁移：1.034±0.117比1.458±0.056， t＝6.600， P<0.05；HCT116侵袭：1.055±0.319比2.026±0.165， t＝6.387， P<0.05；SW1116侵袭：0.941±0.100比2.103±0.111， t＝16.48， P<0.05)，但增殖能力无明显变化。蛋白质谱技术鉴定甲硫氨酰氨肽酶2(METAP2)是LIN28A mRNA过表达后显著上调的可能调控肿瘤转移的靶蛋白。敲减LIN28A后METAP2表达显著低于对照组，差异有统计学意义(HCT116-si#1：1.003±0.052比0.937±0.044， t＝1.371， P>0.05；si#2：1.003±0.052比0.503±0.015， t＝13.11， P<0.05；SW1116-si#1：1.005±0.071比0.993±0.075， t＝0.1623， P<0.05；si#2：1.005±0.071比0.809±0.052， t＝3.141， P<0.05)。与LIN28A mRNA作用一致，敲减METAP2组细胞转移能力明显低于对照组，差异有统计学意义(HCT116迁移和侵袭：1.000±0.055比0.420±0.070， t＝14.60， P<0.05；1.000±0.176比0.200±0.009， t＝8.942， P<0.05；SW1116迁移和侵袭：1.026±0.152比0.350±0.078， t＝7.933， P<0.05；0.982±0.238比0.487±0.030， t＝4.851， P<0.05)。 结论:非编码功能的LIN28A mRNA通过调节METAP2促进结肠癌细胞转移。

(按英文缩写的首字母顺序排列) AD:阿尔茨海默病ALP:碱性磷酸酶ALT:丙氨酸转氨酶AST:天冬氨酸转氨酶Bax: BcL-2相关X蛋白BcL-2:B淋巴细胞瘤-2 BMI:体重指数BUN:尿素氮caspase-3:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 CAT:过氧化氢酶COPD:慢性阻塞性肺疾病CRP:C-反应蛋白CT:计算机断层扫描DAPI:4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAB:二氨基联苯胺DBiL:直接胆红素DMSO:二甲基亚砜DN:糖尿病肾病DNA:脱氧核糖核酸DPN:糖尿病周围神经病变E2:雌二醇ELISA:酶联免疫吸附测定ESR:红细胞沉降率FBS:胎牛血清FDA:食品和药品管理局FEV1:第1秒用力呼气容积FPG:空腹血糖FSH:促卵泡激素FVC:用力肺活量2 hPG:餐后2 h血糖GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶GSH-Px:谷胱甘肽过氧化物酶hCG:人绒毛膜促性腺激素H.pyLori:幽门螺杆菌HbA1c:糖化血红蛋白HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇HE染色:苏木精-伊红染色HPLC:高效液相色谱IBiL:间接胆红素ICU:重症监护室IgG:免疫球蛋白G IL:白细胞介素IOD:积分光密度LDH:乳酸脱氢酶LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇MDA:丙二醛MMP:基质金属蛋白酶MRI:磁共振成像MTT:四甲基偶氮唑盐NF-κB:核因子-κB NK细胞:自然杀伤细胞NO:一氧化氮NOS:一氧化氮合酶NYHA:纽约心脏病协会oR:比值比PaCO2:动脉血二氧化碳分压PaO2:动脉血氧分压PBS:磷酸盐缓冲液PCOS:多囊卵巢综合征PCR:聚合酶链反应PLT:血小板计数RBC:红细胞计数RCT:随机对照试验RSD:相对标准偏差RT-PCR:逆转录-聚合酶链反应SCr:血肌酐SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SOD:超氧化物歧化酶STZ:链脲佐菌素T2DM:2型糖尿病TBiL:总胆红素TC:总胆固醇TG:三酰甘油TGF:转化生长因子TNF:肿瘤坏死因子TTC:2,3,5-氯化三苯基四氮唑TUNEL:末端脱氧核苷酰基转移酶介导dUTP切口末端标记UPLC:超高效液相色谱WBC:白细胞计数Western bLot:蛋白质免疫印迹VAS:视觉模拟评分量表VEGF:血管内皮生长因子WHO:世界卫生组织95% CI :95%可信区间β-actin:β-肌动蛋白

目的 探究旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期排泄分泌产物(ESP)中的差异蛋白,分析两者免疫抑制差异的原因和参与包囊形成的潜在功能蛋白. 方法 收集旋毛虫和伪旋毛虫ESP,采用二喹啉甲酸检测法测定旋毛虫、伪旋毛虫ESP蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质量,对经过超滤管酶解法酶解后的ESP多肽段采用同位素相对定量和绝对定量标记技术(iTRAQ)标记,混合标记后的样品进行液相分离高pH反相色谱和液相串联质谱检测.检测完成后,搜索UniProt数据库中的旋毛虫(Tric hinella spiralis)和伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)数据库,在可信蛋白(得分80以上)的基础上筛选同源蛋白,比较同源蛋白的差异表达情况.利用QuickGO对差异蛋白进行标准化描述.选取9个差异明显的重要蛋白进行实时荧光定量PCR验证,采用△△Ct法验证基因表达水平.采用SPSS 19.0软件进行统计学分析 结果 经iTRAQ标记鉴定出旋毛虫可信蛋白492个,伪旋毛虫535个,可用于定量分析的旋毛虫蛋白193个,伪旋毛虫蛋白164个.旋毛虫/伪旋毛虫同源比对结果显示,表达蛋白上调162个,下调31个.GO分析结果显示,分子功能主要富集在离子结合功能、肽酶活性、氧化还原酶活性和核酸酶活性,分别为45、18、12和8个.在生物过程中,涉及最多的是小分子代谢过程(15个),碳水化合物代谢过程(12个),生物合成过程(12个),DNA代谢过程过程(8个).差异蛋白涉及的细胞组成成分主要为细胞质和含蛋白质的复合物.KEGG分析显示,与硫胺素代谢,鞘糖脂生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成相关的蛋白大部分上调.plancitoxin-1 (E5SXW8)、胰蛋白酶(E5SPA7)、胱抑素(E5S387)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(E5SJH4)、5'-核苷酸酶(E5S554)、烯醇酶(E5SQX1)、L-天冬酰胺酶(E5SBA6)蛋白表达和基因转录水平在旋毛虫肌幼虫时期均高于伪旋毛虫(P＜0.05);热休克蛋白β-1 (E5RZQ6)、组蛋白H2B (E5S7K8)蛋白表达和基因表达水平在旋毛虫肌幼虫时期低于伪旋毛虫(P＜0.05). 结论 旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期ESP差异蛋白生物信息学分析提示丝氨酸蛋白酶、胱抑素、plancitoxin-1和14-3-3蛋白等可能与包囊形成和免疫调节相关.

目的 探讨二烯丙基硫醚(diallyl sulfide,DAS)对二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)和四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的小鼠肝癌合并肝纤维化的干预效果.方法 14日龄雄性ICR小鼠随机分为4组:正常对照组、模型组(DEN+CCl4)、DAS低剂量干预组和DAS高剂量干预组,每组15只.除对照组外,小鼠出生第14天时腹腔注射DEN(25 mg/kg)诱发小鼠肝癌;小鼠出生6周时,每周腹腔注射CCl4(1 ml/kg)2次,持续给予14周诱发肝纤维化.DAS低和高剂量干预组在腹腔注射CC14前2小时分别灌胃DAS(20或40 mg/kg),每天1次,连续给药16周.检测血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase,AST)、γ-谷氨酰转肽酶(Gamma-glutamyl transferase,GGT)的活力和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的含量,比较各组小鼠肝脏系数、肝脏表面癌结节数目,并对肝脏进行病理组织学检查及天狼猩红染色.结果 与正常对照组相比,模型组小鼠肝脏系数明显增加,血清ALT、AST、GGT的活力升高(P＜0.05),AFP含量显著增加(P＜0.05);与模型组相比,DAS干预组小鼠各项指标均明显改善(P＜0.05).DAS干预后肝脏系数明显降低、肝脏表面增生癌结节数目明显减少(P＜0.05).其中高剂量干预组小鼠肝脏表面癌结节数目和血清中AFP含量显著低于低剂量干预组(P＜0.05).HE染色和天狼猩红染色结果表明,与模型组相比,DAS低、高剂量干预组小鼠肝组织切片中肿瘤区减少、细胞核异型性降低,肝纤维化明显减轻.结论 DAS的干预显著抑制了DEN和CCl4诱发的小鼠肝癌合并肝纤维化的进展.

目的 运用比较蛋白质组学方法研究8w中等强度低负荷量运动对增龄大鼠肝脏蛋白质组表达图谱的影响,初步筛选与运动延缓肝脏衰老相关的备选目标蛋白质.方法 将12只18月龄SD大鼠随机分为运动组(n=6)和对照组(n=6).运动组经中等强度运动训练(60％ ～75％VO2 max),与对照组一起提取肝脏组织的全蛋白,并通过固相-pH梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)分离蛋白质,之后运用PD Quest软件数据采集分析图像.选择差异表达量大于2倍的备选目标蛋白斑点进行胶内原位酶解与质谱鉴定.同时检测丙二醛(MAD)、锰离子超氧化物歧化酶(MnSOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSH)活性.结果 与对照组相比,运动组大鼠肝脏组织还原型谷胱甘肽、MnSOD活性、GSH/GSSH比值分别增加138％(P<0.05)、33％(P<0.05)和306％(P<0.01);MDA和GSSH分别减少了60％(P<0.05)和71％(P<0.05);肝脏蛋白差异表达量大于2倍的有12个,经质谱鉴定分别为脂肪酸合成酶(FAS)、α-烯醇化酶(α-enolase)、11-羟化类固醇脱氢酶(11β-HSD1)、核基质结合因子(SAF)B2、乙基丙二酸脑病变相关蛋白(ETHE1)、蛋白酶体β亚单位(PSMB)6、核糖核酸酶抑制因子(RNH)1、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)、角蛋白(Krt)8、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)、主要急性期蛋白(MAP)1和触珠蛋白(HPT).结论 中等强度低负荷量训练后增龄大鼠肝脏的蛋白质组表达图谱发生显著变化;筛选出12种目标差异蛋白,其表达量发生的变化提示,体育运动可能通过调节肝脏的糖脂代谢、蛋白质代谢、脱毒性和抗凋亡等过程来延缓肝脏组织衰老的作用.

[目的]氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是昆虫消化系统中重要的蛋白酶.本研究旨在对在褐飞虱Nilaparvata lugens中肠中两个具有较高转录水平的apn基因(nlapn1和nlapn4)在中肠上皮细胞上的表达及其蛋白功能特性进行鉴定与分析.[方法]利用最大似然法进行褐飞虱NLAPN1和NLAPN4的系统进化分析;利用Western blot分析NLAPN1及NLAPN4在中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMVs)中的定位;利用LC-ESI-MS/MS技术对Western blot定位的NLAPN1及NLAPN4进行鉴定.在果蝇Drosophila S2细胞内分别表达两个NLAPN蛋白,并利用Western blot及免疫荧光定位技术对NLAPN1与NLAPN4进行S2细胞内的定位;分别以L-亮氨酸对硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐(Met-p-NA)和L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐(Lys-p-NA)为底物测定NLAPN1和NLAPN4的酶活性.[结果]系统进化树分析结果显示,褐飞虱NLAPN1及NLAPN4与其他半翅目昆虫肠道中高表达的APN分在了同一分支中.Western blot及LC-ESI-MS/MS质谱分析结果证明NLAPN1与NLAPN4均存在于褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡中,分子量约为160 kD.Western blot及免疫荧光定位结果显示,两个NLAPN蛋白均位于S2细胞膜上,而C端缺失糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点的NLAPN41ackG蛋白分布在细胞质中.酶活性测定结果显示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐及L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐为底物时NLAPN1和NLAPN4都具有一定的酶活性,而以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物时NLAPN1有极高的酶活性(＞ 60 U/mg).[结论]NLAPN1与NLAPN4是褐飞虱中肠上皮细胞膜上高表达的两个膜结合APN蛋白,且都通过C端的GPI锚定附着在细胞膜上.NLAPN1与NLAPN4与鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫中肠膜结合APN有着近似的蛋白结构与酶学特性.膜结合APN在褐飞虱中肠中的生理生化功能及其与外源病原物的互作机制还有待进一步深入研究.