目的 建立同时检测猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)2种病原的双重荧光PCR方法,并进行验证及初步应用.方法 根据NCBI中收录的BVDV 5'UTR和ASFV VP72基因序列,分别设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立一种能同时检测BVDV和ASFV的双重荧光PCR方法.对建立的方法进行灵敏度、特异性和精密性验证.采用建立的方法分别检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)活疫苗和猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)活疫苗(76批次)以及添加 BVDV 和重组质粒pMD-VP72的猪PRV活疫苗(各5瓶)中的BVDV和ASFV,并按照《中华人民共和国兽药典》三部(2020版)和中华人民共和国农业农村部公告第172号规定的方法分别对BVDV和ASFV进行复核检测.结果 建立的双重荧光PCR法最低可检测浓度为4.2拷贝/μL的BVDV重组质粒和浓度为8.7拷贝/μL的ASFV重组质粒;不与其他常见病原体发生交叉反应;重复性和试验间精密性检测的变异系数(CV)均不高于2％.结论 本实验建立的双重荧光PCR方法灵敏度高,特异性强,精密性好,可用于猪用疫苗中外源病毒的快速检测及猪用疫苗等生物制品的质量控制.

目的 分析组织蛋白酶L(CTSL)基因表达与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)预后及免疫浸润的关系.方法 基于癌症和肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库和基因表达综合数据库(GEO)中的GSE41613、GSE65858、GSE27020 和GSE30784 数据集,分析CTSL基因在HNSCC组织和正常组织中的表达差异.根据最佳截断值将HNSCC患者分为CTSL基因高表达和低表达组.采用单因素和多因素Cox回归分析,确定CTSL基因表达对HNSCC的预后预测价值.利用免疫亚型、ESTIMATE法、CIBERSORT法和基因集变异分析(GSVA)法分析CTSL基因高表达和低表达组HNSCC的免疫浸润差异.利用TCGA数据库和GSE65858 数据集分析不同人乳头状瘤病毒(HPV)感染状态下CTSL基因对HNSCC预后和免疫浸润的影响.利用TCGA数据库进行泛癌分析.结果 在TCGA数据库和GSE30784数据集中,CTSL基因在HNSCC组织中的相对表达量分别为 6.90±1.07 和 9.54±0.87,均高于正常组织(分别为 5.46±1.20 和 7.96±0.59,均 P＜0.05).在 TCGA 数据库和GSE65858 数据集中,CTSL基因在HPV阴性HNSCC组织中的相对表达量分别为7.16±0.94 和 8.66±0.54,均明显高于HPV阳性HNSCC组织(分别为 6.10±1.18 和8.41±0.51,均P＜0.05).在TCGA数据库和GSE41613、GSE65858、GSE27020 数据集中,单因素Cox回归分析显示,与CTSL基因低表达组比较,CTSL基因高表达组的 HR值分别为 1.64(95%CI:1.24～2.17,TCGA 数据库总生存时间)、1.62(95%CI:1.15～2.28,TCGA数据库无进展生存时间)、2.42(95%CI:1.31～4.46,GSE41613数据集总生存时间)、2.22(95%CI:1.29～3.81,GSE65858数据集总生存时间)和 2.66(95%CI:1.53～4.63,GSE27020 数据集无病生存时间);多因素Cox回归分析显示,与CTSL基因低表达组比较,CTSL基因高表达组的HR值分别为1.55(95%CI:1.17～2.06,TCGA数据库总生存时间)、1.56(95%CI:1.09～2.21,TCGA数据库无进展生存时间)、2.06(95%CI:1.10～3.88,GSE41613 数据集总生存时间)、2.33(95%CI:1.35～4.02,GSE65858 数据集总生存时间)和 2.64(95%CI:1.48～4.72,GSE27020 数据集无病生存时间).CTSL 基因高表达与HNSCC的不良预后有关(均P<0.05).单因素和多因素荟萃分析显示,CTSL基因高表达组的HR值分别为 1.93(95%CI:1.56～2.39)和 1.84(95%CI:1.48～2.29).在TCGA数据库中,免疫浸润分析结果显示,CTSL基因高表达组HNSCC的免疫浸润水平较高,具有更有利的免疫激活表型.在GSE65858 数据集中,不同CTSL基因和HPV感染状态与HNSCC的预后和免疫浸润相关,与HPV阴性且CTSL高表达组比较,HPV阳性且CTSL低表达组患者的预后相对较好(χ2=15.39,P=0.002).在TCGA数据库中,CTSL基因的表达与多形性胶质细胞瘤、肾透明细胞癌、低级别脑胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌和葡萄膜黑色素瘤的总生存时间有关(均P＜0.05);与多形性胶质细胞瘤、肾透明细胞癌、低级别脑胶质瘤、肺腺癌、肺鳞癌和前列腺癌的无进展生存时间有关,CTSL基因表达越高,患者预后越差(均P＜0.05).结论 CTSL基因的表达水平与HNSCC患者的预后和免疫浸润密切相关,并且与不同HPV感染状态具有相互作用.

目的 分析四川省首例猴痘病例感染病毒全基因组特征,为猴痘防控工作提供基础资料.方法 采集病例咽拭子和疱疹液拭子提取核酸,用实时荧光聚合酶链式反应(PCR)进行初筛,确认阳性后用纳米孔测序进行全基因组测序.测序数据用Minimap2 v2.18-r1015、Medaka v1.8.0、Snpeff v4.3.1软件进行组装、核苷酸突变位点识别和功能注释,通过在线分析平台Nextclade(https://clades.nextstrain.org/)进行型别鉴定,以IQ-TREE v2.1.2软件构建全基因组进化树.结果 3种实时荧光PCR试剂盒检测咽拭子和疱疹液拭子均显示猴痘病毒核酸阳性,且疱疹液拭子每个反应管内荧光信号达到设阈值时所经历的循环数(Ct值)均低于咽拭子.全基因组测序分析显示,该病例感染的猴痘病毒(SC001)属于Ⅱb分支B.1.3基因型,与美国、日本、中国浙江省等地流行的毒株同源(核苷酸相似性99.98％～99.99％),其中与浙江省流行的毒株最为相近(核苷酸相似性99.99％).与参考基因组(NC_063383.1)相比,SC001株含有70个单核苷酸突变位点.结论 四川省首例猴痘病例感染的病毒与我国其他地区流行株的基因型一致,后续应持续关注病毒遗传进化情况,警惕新变异株出现.

金属离子依赖性蛋白在病毒复制、组装和宿主细胞侵袭等关键环节中发挥着核心作用,使其成为抗病毒治疗策略的理想靶点.从药物化学的角度出发,综述了2021-2023年,以金属离子依赖性蛋白为靶标的抗病毒药物研究的新进展.详细分析了人类免疫缺陷病毒、人类巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、裂谷热病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒等重要病毒的金属离子依赖性蛋白抑制剂,探讨了这些抑制剂的药理活性、作用机制及临床应用潜力.同时强调了设计病毒金属酶抑制剂面临的挑战,如确保高度选择性和特异性、药物稳定性、生物利用度等,以及应对病毒高变异率导致的耐药性问题.最后总结了抗病毒药物研发的新趋势,包括结构基础药物设计、高通量筛选、片段生长和多位点结合策略等,为开发新型高效低毒抗病毒药物提供了新的思路和方法.

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)主蛋白酶(main protease,Mpro)在病毒复制周期中发挥关键作用,是抗新冠病毒药物的重要靶点.然而,病毒的快速变异引起了对Mpro抑制剂的耐药性问题,对全球公共卫生构成严重威胁.对SARS-CoV-2 Mpro的耐药机制进行总结,并探讨了新型抗耐药性抑制剂的设计策略.针对Mpro耐药突变对现有抑制剂疗效的影响,提出了多种基于靶标结构的抗耐药性药物设计方法,如多位点占据、变构位点开发、共价结合等策略,此外还探讨了蛋白降解靶向嵌合体(proteolytic targeting chimera,PROTAC)在降解病毒靶蛋白中的应用.为解决SARS-CoV-2 Mpro耐药性问题提供了新思路,并为未来可能出现的冠状病毒疫情提供药物筛选和开发的参考.

目的 构建表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Omicron BA.1变异株S1蛋白的真核表达载体,在CHO-K1细胞中进行表达,评价其免疫原性,并对佐剂和抗原剂量进行研究.方法 构建重组质粒UCOE-Omi-S1,转染至CHO-K1工程细胞中进行表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot法实验鉴定重组S1蛋白.将BALB/c小鼠随机分为12组,即 PBS组,无佐剂组(高、中、低剂量组),铝盐佐剂对照组,MF59佐剂对照组,铝盐佐剂实验组(高、中、低剂量组),MF59佐剂实验组(高、中、低剂量组),将按照分组要求配比的溶液经小鼠肌内注射3次,间隔14天,每2周尾静脉采血,末次免疫30天后取血分离血清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清抗体水平,并和SARS-CoV-2原型株的假病毒和SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株的假病毒进行假病毒中和实验.结果 目的蛋白在CHO-K1工程细胞表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为70kDa处可见1条特异性蛋白表达条带,经Western blot法鉴定为Omi-S1蛋白.铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果优于无佐剂组,铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果相差不大,但MF59佐剂起效快;高、中、低剂量组的免疫诱导效果在第8周相差不大,但高剂量组起效快.假病毒中和实验表明,MF59佐剂实验组针对Omicron变异株的中和抗体水平高于铝盐佐剂组.结论 本研究所构建的Omicron S1重组蛋白免疫原性良好,在小鼠体内产生了良好的体液免疫应答,并诱导高水平的对抗SARS-CoV-2假病毒的中和抗体,对佐剂和抗原剂量初步研究,结果显示,10μg以下抗原剂量搭配MF59佐剂可获得较好的免疫效果.本研究为SARS-CoV-2变异株的重组蛋白疫苗的研制提供了实验基础.

目的:通过分析本土奥密克戎（Omicron）变异株新型冠状病毒（新冠病毒）感染患者临床特征及关键指标，掌握轻、重症患者的临床指标特征，为有效治疗及预防重症发生提供科学依据。方法:采用回顾性比较研究方法，分析2020年1月至2022年3月无锡市第五人民医院收治的新冠病毒感染患者的临床及实验室资料，包括病毒基因亚型、人口学信息、临床分型、主要临床症状、临床检验的关键指标，评价新冠病毒感染患者的临床特征变化。结果:共收治150例新冠病毒感染患者，2020、2021、2022年分别为78、52、20例，其中重症患者分别为10、1、1例，主要感染病毒株分别为L型、Delta型、Omicron变异株。Omicron变异株感染患者复阳率高达15.0%（3/20），腹泻发生率降至10.0%（2/20），重症发生率降至5.0%（1/20），轻症患者住院天数较2020年增加（d：20.43±1.78比15.84±1.12）；呼吸道症状减少，肺部病变比例下降至10.5%；重症患者Omicron变异株感染急性期（第3天）病毒滴度较L型毒株高（Ct值：23.92±1.16比28.19±1.54）；Omicron变异株新冠病毒感染重症患者急性期血浆细胞因子白细胞介素（IL-6、IL-10）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）显著低于轻症患者〔IL-6（ng/L）：3.92±0.24比6.02±0.41，IL-10（ng/L）：0.58±0.01比4.43±0.32，TNF-α（ng/L）：1.73±0.02比6.91±1.25，均 P<0.05〕，而γ-干扰素（IFN-γ）和IL-17A显著高于轻症患者〔IFN-γ（ng/L）：23.07±0.17比13.52±2.34，IL-17A（ng/L）：35.58±0.08比26.39±1.37，均 P<0.05〕。与既往疫情（2020、2021年）相比，2022年Omicron感染轻症患者中CD4/CD8比值、淋巴细胞计数、嗜酸粒细胞及血肌酐下降的患者比例大（36.8%比22.1%、9.8%，36.8%比23.5%、7.8%，42.1%比41.2%、15.7%，42.1%比19.1%、9.8%），单核细胞计数和降钙素原升高的患者比例大（42.1%比50.0%、23.5%，21.1%比5.9%、0）。 结论:Omicron变异株新冠病毒感染患者的重症发生率较既往明显降低，重症的发生仍与基础疾病有关。

目的:了解新型冠状病毒（SARS-CoV-2）灭活疫苗对奥密克戎变异株感染者临床结局的影响。方法:以2022年1月1日至5月31日广东省20家定点医院收治的1 403例奥密克戎变异株感染者为对象，基于中国疾病预防控制信息系统和广东省远程医疗平台收集对象人口学资料、基础疾病资料、疫苗接种情况、末次暴露日期、感染毒株基因测序和临床结局等资料，采用病例对照研究设计，将肺炎（普通型、重型和危重型）作为病例组，非肺炎（无症状感染者和轻型）作为对照组，分析SARS-CoV-2灭活疫苗对奥密克戎变异株感染者临床结局影响。结果:1 403例对象年龄的 M（ Q1， Q3）为36（27~47）岁，男性占52.25%（733例）。感染结局以非肺炎为主，占92.09%（1 292例），病程的 M（ Q1， Q3）为18（14~22）d。无免疫史或部分免疫、基础免疫90 d内、基础免疫90 d以上、完成加强免疫90 d内和完成加强免疫90 d以上者分别为134（9.55%）、39（2.78%）、403（28.72%）、437（31.15%）和390（27.80%）例。多因素logistic回归分析显示：调整性别、年龄、基础病和报告地等因素后，与无免疫史或部分免疫者比较，基础免疫90 d以上、加强免疫90 d内、加强免疫90 d以上者发展为肺炎风险较低［ OR（95% CI）值分别为0.52（0.28~0.98）、0.39（0.21~0.73）和0.40（0.21~0.77）］。Cox比例风险回归模型分析显示：调整性别、年龄、基础疾病和报告地等因素后，与无免疫史或部分免疫者相比，加强免疫90 d以上者病程较短［ HR（95% CI）：1.26（1.03~1.55）］。 结论:新冠病毒灭活疫苗接种史影响奥密克戎变异株感染者临床结局。

目的:探讨"四素一肽两移植"集束化治疗新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）患者的应用规律及效果，为有效治疗及预防重症发生提供科学依据。方法:采用回顾性比较研究方法，分析2020年1月至2022年3月无锡市第五人民医院收治的新冠肺炎患者的临床资料，包括人口学信息、基础疾病、临床分型、住院时间、治疗费用、临床症状、实验室检查等关键指标，评价"四素一肽两移植"集束化治疗新冠肺炎患者的应用规律及效果。结果:2020年以L型新冠病毒株为主，2021年以德尔塔变异株为主，2022年以奥密克戎变异株为主；轻型病例比例也在2022年最高，>65岁年龄组患者发展为重型和危重型的比例最高。纳入的150例患者，"四素一肽两移植"集束化治疗方案中干扰素使用率最高（100.0%）；2022年维生素C、干扰素和胸腺肽联合使用率最高；>65岁年龄组75.0%存在基础疾病，也是"四素一肽两移植"使用比例最高的年龄组。与轻型患者相比，随着严重程度增加新冠肺炎患者的年龄、住院时间及人均住院费用均显著增加。轻型、普通型、重型和危重型患者均出现了淋巴细胞计数降低，有40.0%的重型患者在入院3 d内出现淋巴细胞计数最低；危重型患者入院时淋巴细胞计数降低或持续降低，采用调节免疫的"四素一肽两移植"的方法可有效挽救危重型患者的生命。新冠病毒感染的所有病例中，51.3%为无症状感染者，其次以呼吸道症状（48.7%）和肺部病变（38.0%）为主。肾功能异常患者使用"四素一肽两移植"集束化治疗的比例最高，其次为凝血功能异常患者和肝功能异常患者。该集束化治疗促进各种临床分型患者CD4 + T淋巴细胞和B淋巴细胞明显增加；成人患者治疗后随着病毒转阴，M1型巨噬细胞比例升高，抑制免疫的调节性T细胞（Treg）和感染相关的CC趋化因子受体10 +（CCR10 +）Treg细胞比例减少，轻型患者变化幅度更大、下降更快。 结论:高龄伴基础疾病是新冠肺炎重症发生的危险因素；对患者进行"四素一肽两移植"集束化精细治疗可改善其淋巴细胞构成比例和器官功能，可控制重症发生发展并延长生命；除CD4 + T细胞比例，M1型巨噬细胞、总Treg细胞和CCR10 +Treg细胞比例也可用于判断成人患者病情变化。

新型冠状病毒引起的全球卫生危机仍在继续，而且病毒不断发生变异，传播速度逐渐变快。既往研究表明，维生素D可以在调节免疫、抑制炎症、干预肾素-血管紧张素系统等方面发挥作用，而且低维生素D水平与新型冠状病毒肺炎(COVID-19)严重程度以及死亡率之间存在联系。因此维生素D在减轻COVID-19病情严重程度上具有一定价值。但是目前的临床研究还没有明确维生素D用于广泛人群预防重症新冠肺炎的最佳补充剂量，这仍需要进一步的基础和临床试验来探索。