目的:本研究对2019年陕西省三带喙库蚊标本中分离的病毒(SX1943)进行病毒学和分子生物学鉴定。方法:蚊虫研磨液接种组织培养细胞，对分离物进行病毒学和病毒分子遗传学分析。结果:在2019年于陕西省采集的三带喙库蚊标本中获得1株病毒分离物(SX1943)，将该病毒接种至C6/36细胞后第3天发生明显细胞病变，表现为细胞圆缩、聚集和脱落等，分离物可稳定传代。然而，该批标本在BHK-21细胞连续传代3次均未发现显著细胞病变。SX1943病毒接种至C6/36细胞后经电子显微镜(负染)观察，可见大量圆形病毒颗粒，直径约25 nm。SX1943病毒基因组扩增与测序结果显示，该病毒基因组序列全长为3 594 nt，共编码3种蛋白，分别为非结构蛋白(NS1和NS2)和衣壳蛋白(VP)，3种蛋白的基因长度分别为2 376 nt、1 098 nt和1 136 nt。经病毒分子遗传进化分析发现，SX1943病毒与浓核病毒亚科 Brevidensovirus病毒属中的淡色库蚊浓核病毒(Culex pipiens pallens Densovirus, CppDNV)处于同一进化分支，上述结果提示SX1943病毒为CppDNV。 结论:陕西省三带喙库蚊中分离到CppDNV。

目的:了解2016年至2019年云南省德宏傣族景颇族自治州(以下简称"德宏州")境内新报告缅甸籍人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)/丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)合并感染者的HIV和HCV基因亚型分布特征。方法:通过全国艾滋病综合防治数据信息系统收集2016年1月至2019年12月德宏州境内新报告缅甸籍HIV/HCV合并感染者共1 289例，选取血浆样本留存量≥200 μL的996例患者进行HIV和HCV基因亚型检测。采用巢式聚合酶链反应分别扩增HIV pol基因区、HCV核心蛋白结合包膜蛋白(core protein-binding envelope protein， CE1)基因区和非结构蛋白5B(non-structural protein 5B， NS5 B)基因区，通过MEGA 7.0软件构建系统进化树，明确基因分型。统计学分析采用 χ2检验，采用趋势 χ2检验分析HIV和HCV基因亚型逐年变化趋势。 结果:996例HIV/HCV合并感染者中，554例(55.6%)成功扩增HIV和HCV基因片段并明确分型。HIV和HCV基因分型呈多样化。HIV基因亚型以C型和BC重组亚型为主，分别占40.3%(223/554)和33.6%(186/554)；其次为B型、流行重组型(circulating recombinant form，CRF)01_AE型，分别占6.5%(36/554)和3.6%(20/554)。HCV基因亚型以3b型为主，占31.2%(173/554)；其次为6u、1a、6n、3a、6xg型，分别占19.5%(108/554)、17.5%(97/554)、11.4%(63/554)、8.7%(48/554)、6.3%(35/554)。2016年至2019年HIV C型的构成比呈逐年下降趋势( χ趋势2＝7.23， P<0.001)，BC重组亚型呈上升趋势( χ趋势2＝5.97， P<0.001)。2019年BC重组亚型构成比为54.9%(101/184)，高于C型的21.7%(40/184)。2016年至2019年HCV 3b型、6u型、1a型的构成比无明显变化趋势( χ趋势2＝1.43、1.79、0.39， P＝0.152、0.074、0.695)。不同民族患者的HIV基因亚型分布差异有统计学意义( χ2＝22.06， P＝0.037)。 结论:德宏州境内缅甸籍HIV/HCV合并感染者的HIV和HCV基因亚型种类复杂多样。其中，HIV BC重组亚型成为优势传播毒株的趋势显著，需要进一步加强对境内缅甸籍人群中HCV和HIV基因亚型流行特征的监测。

目的:探讨呼吸道合胞病毒非结构蛋白（NS）1氨基酸变异情况及临床特征的关系。方法:回顾性病例研究。纳入2018年12月至2020年1月重庆医科大学附属儿童医院呼吸科住院的81例单一呼吸道合胞病毒阳性患儿为研究对象，分别对呼吸道合胞病毒A、B亚型NS1基因进行PCR扩增、测序，对氨基酸序列进行分析。采用 χ2检验和Mann-Whitney秩和检验比较NS1有无变异两组患儿临床特征及其Ⅰ型干扰素水平。 结果:81例单一呼吸道合胞病毒阳性患儿中男58例、女23例。变异组11例，发病年龄2.0（1.0，11.0）月龄，A亚型4例，变异位点分别为Lys33Gln 2例，Gly2Asp、Pro67Ser、Leu137Phe各1例；B亚型7例，变异位点分别为Val121Ile 2例，Tyr30Cys、Val65Met、Asn85Ser、Ser118Asn、Asp124Asn各1例；所有变异位点在美国国家生物技术信息中心蛋白质数据库中的频率为0.08（0.04，0.29）%。无变异组70例，发病年龄为3.5（1.0，7.0）月龄。变异组呼吸困难发生率高于无变异组［10/11比47%（33/70）， χ2=7.31， P<0.01］。 结论:呼吸道合胞病毒NS1氨基酸存在一定的变异，变异后患儿可能更易出现呼吸困难。

目的:建立西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)假病毒的体内感染模型，并对抗体WNV-XH1进行体内中和活性评价。方法:利用前期建立的可包装WNV假病毒的稳定细胞株制备假病毒上清，将上清浓缩后感染BHK21细胞检测假病毒滴度。假病毒经腹腔注入C57BL/J小鼠体内后进行生物发光成像，观测小鼠体内假病毒感染情况。同时感染后取血，ELISA检测小鼠血清中NS1水平。利用建立的小鼠感染模型，评价抗体WNV-XH1的体内功能活性。结果:C57BL/J小鼠感染WNV假病毒后，体内可检测到荧光，且感染假病毒的小鼠与未感染的小鼠相比外周血血清中WNV非结构蛋白NS1水平明显升高(1.453±0.09vs0.305±0.018)。攻毒前静脉给予抗体WNV-XH1后，小鼠体内荧光信号减弱，血清中NS1水平下降(0.384±0.015)。结论:成功建立WNV假病毒体内感染模型，并证实抗体WNV-XH1在体内对WNV假病毒的感染具有保护作用。

目的:建立快速荧光灶试验(fluorescence focus assay，FFA)滴定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的方法，验证该法替代病毒蚀斑法测定乙型脑炎减毒活疫苗(简称乙脑减毒活疫苗)滴度的可行性并将该法作初步应用。方法:利用原核表达方式构建JEV非结构蛋白1(non-structural protein 1，NS1)重组体系，以纯化所得的JEV-NS1蛋白免疫家兔制备抗NS1蛋白多克隆抗体，建立快速FFA测定JEV滴度的方法。通过与病毒蚀斑法作比对分析，对其专属性、准确度、精密度、线性、范围和耐用性进行验证。用经验证后的FFA检测28批乙脑减毒活疫苗，分析其应用于生产的可行性。结果:所制备的多克隆抗体与JEV可产生特异性荧光灶反应，与其他病毒(森林脑炎病毒、黄热病毒、人柯萨奇病毒A2型和A4型)无交叉反应；FFA方法学验证结果均符合乙脑减毒活疫苗的质控要求；与蚀斑法比较，FFA检测结果更趋一致。结论:本研究建立的FFA通过方法学验证，可应用于乙脑减毒活疫苗成品的滴度测定。

3例患者（例1男，27岁，慢性丙型肝炎；例2男，71岁，丙型肝炎合并肝细胞癌；例3男，60岁，丙型肝炎失代偿期肝硬化）服用含达拉他韦方案治疗丙型肝炎病毒（HCV）感染出现耐药或治疗失败。例1和2均服用达拉他韦联合阿舒瑞韦治疗。2例患者在治疗前检测HCV非结构蛋白（NS）5A均未发现耐药变异。例1在治疗第4周和第24周（停药时）检测HCV RNA均<15 IU/ml；停药10 d后出现病毒学突破，HCV序列检测示S122G、L31V、Y93H和C316N的4个位点变异。例2在治疗第8周时HCV RNA<15 IU/ml，12周时出现病毒学突破。2例患者均给予索磷布韦/维帕他韦联合利巴韦林治疗12周，并获得持续病毒学应答（SVR）。例3接受索磷布韦联合达拉他韦治疗24周，治疗第4、12周和第24周（停药时）检测HCV RNA均为<15 IU/ml，停药12周出现病毒学突破，给予索磷布韦/维帕他韦联合利巴韦林治疗24周，获得SVR。

目的 建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)微流控芯片技术的快速检测蚊媒携带登革病毒的方法.方法 根据登革病毒衣壳蛋白(C)、前膜蛋白(prM)和非结构蛋白2A(NS2A)基因片段构建pUC-GW-Amp-CprM和pUC-GW-Amp-NS2A质粒,设计多组环介导等温扩增特异性引物组.制备LAMP微流控芯片,以靶基因质粒、登革病毒核酸为模板进行检测,根据起峰时间、相对荧光单位、假阳性、重复实验稳定性、检测灵敏度等指标筛选最优引物组.用最优引物组分别检测埃及伊蚊、白纹伊蚊等主要登革热传播媒介和常见的致倦库蚊、中华按蚊、摇蚊的cDNA,并与寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、恶性疟原虫、黄热病毒等常见蚊媒传播病原体进行交叉检测,评价LAMP法的特异性.评价LAMP法检测CprM和NS2A靶基因质粒的灵敏度,分别与PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)检测结果进行比较.用登革病毒RNA与传播媒介埃及伊蚊、白纹伊蚊RNA分别以1∶10、1∶100和1∶1 000混合,模拟媒介携带登革病毒的样品进行LAMP微流控芯片检测.对采集自宁德市三都岛、西安市、上海朱家角、长兴岛和五角场等5地的白纹伊蚊的cDNA进行检测.结果 引物组筛选结果显示,CprMG2和NS2AG1引物组起峰时间早,相对荧光单位高,灵敏度最高,为最优引物组.CprMG2引物组可检测浓度低至10-6ng/μl的pUC-GW-Amp-CprM质粒,最低检测限为1.3 × 103拷贝;NS2AG1引物组可检测浓度低至10-9 ng/pl的pUC-GW-Amp-NS2A质粒,最低检测限为1拷贝.最优引物组CprMG2、NS2AG1对埃及伊蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、致倦库蚊、摇蚊等蚊虫cDNA无非特异性扩增,与寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、恶性疟原虫、黄热病毒核酸无交叉反应.LAMP微流控芯片检测CprM靶基因的最低检测限为1.3 × 103拷贝,较PCR检测的最低检测限(1.3 × 104拷贝)高1个数量级;LAMP微流控芯片检测CprM和NS2A靶基因的最低检测限分别为1.3×103拷贝、1拷贝,与qPCR检测的最低检测限(1.3 × 103拷贝、1拷贝)相当.LAMP微流控芯片检测模拟现场样品的结果显示,CprMG2可检出与埃及伊蚊、白纹伊蚊RNA 1∶10、1∶100和1∶1 000混合的登革病毒RNA,NS2AG1最低可检出1∶100混合的登革病毒,特异性均为100％.LAMP微流控芯片检测5地现场采集白纹伊蚊的结果均为阴性.结论 建立了基于LAMP微流控芯片检测登革病毒的方法,该法敏感性和特异性高,检测时间短,可用于现场蚊媒携带登革病毒的检测.

目的 探讨慢性丙型肝炎病毒(HCV)通过PCNA钳位相关因子(PCLAF)调控肝癌细胞静止的潜在机制.方法 HCV感染后,检测肝癌细胞HUH7的细胞周期分布.HCV感染或不感染后,肝癌细胞进行RNA-seq,使用siRNA敲低差异基因并检测细胞周期分布.过表达PCLAF后检测肝癌细胞的细胞周期分布.过表达HCV的非结构蛋白5A(NS5A)后,检测肝癌细胞PCLAF的表达和细胞周期分布.PCLAF抑制剂α-常春藤皂苷处理后,检测HCV对肝癌细胞周期分布的影响.结果 HCV感染后,肝癌细胞G0期和G1期细胞分布减少(P＜0.05),而S期和G2/M期细胞分布增加(P＜0.05).敲低PCLAF后肝癌细胞G0期细胞分布增加(P＜0.05).HCV感染的情况下,过表达PCLAF后肝癌细胞G0期细胞分布减少(P＜0.05).过表达NS5A后,肝癌细胞PCLAF mRNA和蛋白相对表达量升高(P＜0.05).过表达NS5A后,肝癌细胞G0期和G1期细胞分布减少(P＜0.05),而S期和G2/M期细胞分布增加(P＜0.05).但过表达NS5A的同时敲低PCLAF后,肝癌细胞的细胞周期分布无显著变化.过表达NS5A同时α-常春藤皂苷处理后,肝癌细胞的细胞周期无显著变化.HCV感染同时α-常春藤皂苷处理后,肝癌细胞的细胞周期无显著变化.结论 HCV诱导肝癌细胞跨越G0/G1期静止,减少细胞分裂时间.HCV的NS5A蛋白通过提高PCLAF的表达而抑制肝癌细胞静止.PCLAF抑制剂α-常春藤皂苷可以阻断HCV抑制的肝癌细胞静止.

目的 阐明重组表达乙脑病毒非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)与包括乙脑病毒在内的多种蚊传黄病毒的抗原抗体反应,以及对乙脑病毒感染患者急性期血清标本的抗原抗体反应.方法 本研究使用大肠杆菌原核表达载体(prokaryotic expression vector,pET)系统,重组表达乙脑病毒NS1基因.使用Western Blot实验方法检测重组表达蛋白质与多种,包括乙脑病毒在内的蚊传黄病毒抗体的反应,以及乙脑病毒感染患者急性期血清的抗原抗体反应.结果 乙脑病毒(P3株)NS1基因表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性的表达产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE,简称变性胶)显示为单一条带,分子量约为45 000.进一步的抗原抗体分析结果表明,表达产物与乙脑病毒(蚊虫分离株,脑炎患者分离株)多克隆或者单克隆抗体以及乙脑病毒感染病人急性期血清标本可以获得完全一致的抗原/抗体杂交反应.重组表达产物与蚊传黄病毒,如登革病毒和黄热病毒多克隆抗体之间抗原/抗体杂交反应为阴性,但与西尼罗病毒和墨累谷脑炎病毒多克隆抗体呈现抗原/抗体阳性杂交反应.结论 本文成功获得乙脑病毒NS1蛋白的重组表达并分析了重组蛋白对多种蚊传黄病毒及乙脑病毒感染患者标本之间的抗原/抗体反应,研究结果对于阐明乙脑病毒NS1蛋白与蚊传黄病毒之间抗原抗体反应提供了重要的基础数据.本研究所获得重组表达蛋白为进一步研究乙脑病毒NS1蛋白质功能等提供了重要的物质基础.

目的 了解2019年西双版纳暴发登革热主要流行血清型登革热1型病毒(Dengue virus-1,DENV-1)分子特征,为当地登革热流行的预防控制提供依据.方法 在C6/36细胞上对1株从2019年西双版纳发热患者血液中分离到的DENV-1病毒(JHS45)进行复壮,采用二代测序的方法对该株病毒进行测序,采用CLC Genomics workbench 8.0生物信息学软件对测序数据组装,使用Lasergene软件、MEGA6.1等进行序列比对、系统进化树构建及氨基酸位点分析.结果 JHS45株病毒在C6/36细胞上6d出现细胞病变.测序组装后获得JHS45株病毒1条10687个核苷酸(nt)长序列(GeneBank登录号:OR593353).遗传进化分析结果JHS45株病毒与我国2019年西双版纳、广州、河南、浙江流行的以及2013年泰国流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒形成一个进化分枝,核苷酸同源性为97.6％～99.9％,氨基酸同源性为99.1％～100％;分析发现与2019年云南西双版纳(MW386863)和广州(MW261839)流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒位于同一个较小的进化分枝,它们之间同源性最高,核苷酸同源性均为99.9％,氨基酸同源性均为100％;JHS45株病毒与2015年以来西双版纳流行的DENV-1进行氨基酸差异位点分析,在JHS45株病毒编码区共存在40个氨基酸差异位点,主要集中在非结构蛋白的NS3区域和NS5区域.结论 全基因序列分析结果显示JHS45株病毒为DENV-1基因型1病毒,该次西双版纳登革热疫情与西双版纳、广州、河南、浙江流行的病毒株遗传进化关系比较密切,为云南省乃至我国的登革热疫情监测、病毒进化研究以及防控策略制定提供科学依据.