目的 回顾性分析中山地区角膜移植手术适应证和手术方式的变化趋势.方法 对2008年1月至2022年12月在中山市人民医院施行角膜移植手术的病例资料进行统计,分析角膜移植手术适应证和手术方式的现状及发展趋势.结果 本研究共有200只眼纳入统计,其中角膜白斑51例(25.5％),感染性角膜炎45例(22.5％),眼外伤28例(14.0％),各类型角膜变性与营养不良17例(8.5％),角膜肿瘤17例(8.5％),圆锥角膜15例(7.5％),大泡性角膜病变13例(6.5％),再次手术12例(6.0％),其他角膜病变(青光眼虹膜睫状体综合征、蚕蚀性角膜溃疡)2例(1.0％).在45例感染性角膜炎中,细菌性角膜炎31例(68.99％),真菌性角膜炎10例(22.22％),单纯疱疹病毒性角膜炎4例(8.89％).穿透性角膜移植手术122例(61％),板层角膜移植手术66例(33％),角膜内皮移植手术10例(5％),角膜缘干细胞移植手术2例(1％).结论 中山地区角膜移植手术适应证前三位依次为角膜白斑、感染性角膜炎和外伤.穿透性角膜移植术仍是角膜移植手术的首选术式,而角膜成分移植手术的开展数量逐年增加,大大提高了供体角膜的利用率.

目的:制备新型冠状病毒野生株(WT)、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1分支)等7株单克隆病毒株，用于申请国家标准株。方法:利用蚀斑纯化技术感染Vero细胞后筛选单克隆毒株，通过观察细胞病变特性与病毒形态学特征、病毒滴度与全基因组序列测定、支原体检测等方法，以评价单克隆毒株的基础生物学特征。结果:WT株、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1)7株病毒感染细胞后，细胞病变表现为细胞圆缩脱落；蚀斑纯化后的病毒支原体检测均为阴性，2代至5代的病毒滴度在10 5～10 8 TCID 50/ml之间；电镜下病毒颗粒呈圆形或者椭圆形，直径在60～140 nm之间；全基因组测序与系统进化分析明确了7种毒株的变异株类别，证实了单克隆毒株连续传代5代基因组特征稳定。 结论:制备7种代表性新型冠状病毒变异株的克隆株，具有典型冠状病毒细胞病变效应、形态结构清晰、病毒活性良好、遗传稳定等特性，可作为候选毒株用于申请国家标准株。

目的:利用CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2，HSV-2)。方法:利用CRISPR/Cas9技术对外源基因EGFP插入HSV-2基因组的策略进行探索，设计如下4种插入策略：(1)经典的同源重组修复模式，即环状双侧同源臂供体介导的基因敲入；(2)线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入；(3)同源性非依赖介导的基因敲入；(4)利用稳表达Cas9和sgRNA的细胞株，进行环状双侧同源臂供体介导的基因敲入。结果:使用策略2、3和4均成功构建了携带EGFP的HSV-2，其中策略2的基因敲入效率最高，然后依次为策略3、策略4，策略1未观察到重组病毒的产生。蚀斑纯化后的重组病毒在7代内能稳定表达绿色荧光蛋白，并且和亲本株在Vero细胞上具有相似的生长特性。结论:线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入效率更高，敲除载体的稳转细胞株能够有效地提高同源重组修复机制介导的基因敲入效率。

目的:研究仙台病毒(Sendai virus，SeV)预存免疫对基于仙台病毒载体开发的Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 2，HSV-2)疫苗SeV-dF/HSV-2 ICP27和SeV-dF/HSV-2 gD免疫效果的影响，为克服预存免疫的影响提供数据参考。方法:使用不同剂量(3lg、4lg、5lg、6lg、7lg、8lg CIU)仙台病毒免疫小鼠，建立不同程度预存免疫模型。对建立了预存免疫的小鼠分别免疫SeV-dF/HSV-2 ICP27和SeV-dF/HSV-2 gD，采用酶联免疫斑点检测(ELISPOT)法测定小鼠脾淋巴细胞分泌的ICP27特异性IFN-γ活性，蚀斑减少中和试验(PRNT 50)测定小鼠血清中HSV-2中和抗体效价。 结果:小鼠经不同剂量仙台病毒免疫后建立了预存免疫，且仙台病毒中和抗体效价随着免疫剂量的增加而升高，呈现剂量依赖效应。3lg～8lg CIU仙台病毒免疫小鼠所建立的预存免疫均可对SeV-dF/HSV-2 ICP27诱导的细胞免疫产生显著抑制作用，但对SeV-dF/HSV-2 gD诱导的体液免疫未产生显著抑制作用。结论:预存免疫对基于仙台病毒载体开发的疫苗的影响需要考虑预存病毒中和抗体是否存在，同时病毒载体表达何种外源蛋白也是需要考虑的因素之一。

目的:构造乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)/寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)嵌合株JEV/ZIKV包膜蛋白D393E突变的病毒感染性克隆并进行突变株的拯救，探讨D393E突变对病毒小鼠脑内神经毒力的影响情况。方法:利用分子克隆和重叠延伸PCR技术构造含D393E突变的嵌合病毒质粒，并用线性化处理后的质粒片段进行转录，取得病毒RNA，电转染入细胞，获得突变株。用突变病毒、源病毒分别感染细胞和小鼠，对比两种病毒的复制效率、蚀斑特点以及脑内神经毒力差异。结果:酶切结果证实：突变株JEV/ZIKV (D393E)感染性克隆成功地构建。病毒蚀斑实验：JEV/ZIKV (D393E)的蚀斑直径为0.7±0.2 mm，JEV/ZIKV蚀斑直径为1.3±0.2 mm。病毒小鼠脑内毒力检测：JEV/ZIKV (D393E)的LD 50为31.51PFU，JEV/ZIKV的LD 50为2.21PFU。 结论:ZIKV D393E突变使嵌合病毒对小鼠的脑内神经毒力减弱。

目的:对水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）病毒滴定方法进行优化，并应用于中和抗体检测和抗病毒药物体外检测。方法:采用VZV疫苗株Voka株在48孔板感染人视网膜上皮细胞（adult retinal pigment epithelial cell line-19，ARPE-19），连续7 d检测感染后病毒复制动力学与蚀斑特点；分别建立并优化活病毒滴定的蚀斑染色法和酶联免疫斑点法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT），同时对两种方法检测结果的相关性进行分析，并将改进后的方法应用于VZV药物抑制效果检测和血清中和抗体检测。结果:VZV感染ARPE-19细胞（感染复数为0.05）后，第6天到达复制顶峰并形成肉眼可见蚀斑；蚀斑染色法中，添加0.2 mg/mL二乙胺乙基葡聚糖（diethylaminoethyl-dextran，DEAE-Dextran）后，较未添加组产生更大与边缘更加清晰的蚀斑。ELISPOT法可在感染后第3天进行计数，同时通过改变检测用抗体与显色液等，可产生更加清晰可计的斑点。两种方法可采用机器计数，检测病毒滴度或应用于体外检测抗VZV药物效力与血清中和抗体滴度，具有良好的相关性。结论:优化后ELISPOT法快捷灵敏，可替代蚀斑染色法应用于VZV病毒滴度检测与相关应用。本研究为VZV的检测及疫苗药物研发提供了更简捷可靠的实验方法。

目的:研究小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)感染C57BL/6小鼠诱导自然杀伤(natural killer，NK)细胞免疫应答的最佳剂量和最佳时间。方法:分别根据剂量和时间效应进行分组，剂量效应：无特定病原体( specific pathogen free，SPF)级8周龄C57BL/6雌鼠15只，根据MCMV滴度分为四组，未感染的0个蚀斑形成单位(plaque forming unit，PFU)组(3只)、2.5×10 4PFU组(4只)、5.0×10 4PFU组(4只)和10.0×10 4PFU组(4只)，随后常规饲养7天；时间效应：将8周龄C57BL/6雌鼠14只随机分为四组，分别为0天组(4只)、3天组(4只)、7天组(4只)、14天组(2只)，建模0天腹腔注射5.0×10 4PFU的MCMV感染各组小鼠。在感染后对应天数处死各组小鼠，取小鼠脾脏制成单细胞悬液，并用流式细胞术分析各种组NK细胞比例、Ly49H及颗粒酶B(granzyme B，GZMB)、NK细胞溶酶体相关膜蛋白-1(CD107a)和γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)的表达。 结果:MCMV感染7天后，与0 PFU组相比，2.5×10 4PFU组、5.0×10 4PFU组和10.0×10 4PFU组脾脏NK细胞占淋巴细胞的比例明显下降{(1.90±0.32)%比[(0.91±0.14)%，(0.62±0.16)%，(0.85±0.26)%]， F＝21.271， P<0.05}，CD27 ＋CD11b ＋NK细胞比例显著下降{(22.40±4.55)%比[(13.20±1.29)%，(10.78±1.21)%，(11.38±1.76)%]， F＝17.272， P<0.05}，CD11b ＋NK细胞比例显著增加{(59.87±5.33)%比[(71.08±1.82)%，(74.25±1.95)%，(70.90±2.49)%]， F＝14.641， P<0.05)}，CD43 ＋KLRG1 ＋NK细胞占NK细胞的比例增加{(39.40±5.73)%比[(77.00±0.67)%，( 81.23±2.21)%，( 76.63±7.36)%]， F＝55.282， P<0.05)}，Ly49H ＋NK细胞亚群数量显著增加{(42.07±1.21)%比[(63.50±1.30)%，(63.58±3.71)%，(61.68±4.84)%]， F＝32.273， P<0.05)}，组间差异具有统计学意义。在NK细胞功能方面，MCMV感染7天后，与0 PFU组相比，2.5×10 4PFU组、5.0×10 4PFU组和10.0×10 4PFU GZMB的表达显著增加{(287.00±30.79)%比[(384.25±63.91)%，(529.75±66.08)%，(466.50±83.38)%]， F＝8.730， P<0.05}，IFN-γ分泌减少{(36.00±5.33)%比[(4.88±3.35)%，(3.03±1.56)%，(3.61±2.18)%]， F＝87.663， P<0.05}。时间效应的比较结果显示，MCMV感染3天后，NK细胞CD107a和颗粒酶B表达与0天相比显著升高[(22.98±4.58)%比(6.32±0.75)%，(5969.25±1159.86)%比(788.50±88.17)%， F值分别为41.072和67.448， P值均<0.05]，差异具有统计学意义。 结论:本研究表明，MCMV感染C57BL/6小鼠模型可选择的最佳感染剂量为5×10 4PFU，最佳建模时间为感染后3天。

目的:建立快速荧光灶试验(fluorescence focus assay，FFA)滴定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的方法，验证该法替代病毒蚀斑法测定乙型脑炎减毒活疫苗(简称乙脑减毒活疫苗)滴度的可行性并将该法作初步应用。方法:利用原核表达方式构建JEV非结构蛋白1(non-structural protein 1，NS1)重组体系，以纯化所得的JEV-NS1蛋白免疫家兔制备抗NS1蛋白多克隆抗体，建立快速FFA测定JEV滴度的方法。通过与病毒蚀斑法作比对分析，对其专属性、准确度、精密度、线性、范围和耐用性进行验证。用经验证后的FFA检测28批乙脑减毒活疫苗，分析其应用于生产的可行性。结果:所制备的多克隆抗体与JEV可产生特异性荧光灶反应，与其他病毒(森林脑炎病毒、黄热病毒、人柯萨奇病毒A2型和A4型)无交叉反应；FFA方法学验证结果均符合乙脑减毒活疫苗的质控要求；与蚀斑法比较，FFA检测结果更趋一致。结论:本研究建立的FFA通过方法学验证，可应用于乙脑减毒活疫苗成品的滴度测定。

目的 了解沃尔巴克氏体介导的抗病原体特性能否干扰流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)复制,探讨沃尔巴克氏体对库蚊传播的JEV复制的调控作用.方法 通过实时荧光定量PCR和RNA原位杂交检测Aa23白纹伊蚊细胞(天然感染沃尔巴克氏体)和阴性对照Aa23T白纹伊蚊细胞(以四环素处理清除沃尔巴克氏体感染),定量分析沃尔巴克氏体的生长浓度;通过病毒蚀斑滴定检测Aa23细胞(天然感染沃尔巴克氏体细胞系)和阴性对照Aa23T细胞(不含沃尔巴克氏体的细胞系)在感染JEV(P3株)后第1天至第8天的病毒复制滴度和细胞病变效应.结果 实时荧光定量PCR和RNA原位杂交分析结果表明,Aa23T细胞中沃尔巴克氏体感染呈阴性,Aa23细胞中沃尔巴克氏体的WSP基因拷贝数和靶向沃尔巴克氏体16SrDNA的荧光信号强度随细胞生长时间增长而增高;蚀斑滴定实验结果显示,携带沃尔巴克氏体的细胞系(Aa23)感染JEV后出现细胞病变的时间明显延迟,Aa23细胞中病毒复制滴度(106PFU/mL)与对照细胞病毒复制滴度(108 PFU/mL)相比明显降低.结论 沃尔巴克氏体明显延迟JEV对细胞的致病变作用,减少JEV复制.本研究证明了沃尔巴克氏体对以库蚊为主要传播媒介的JEV具有抑制作用,揭示了沃尔巴克氏体具有抗库蚊传播病毒的潜力,特别是对利用基于沃尔巴克氏体的蚊媒控制技术防控JEV的传播提供了重要的基础数据和理论依据.

目的 建立蚀斑法用于呼吸道合胞病毒的病毒滴度测定,并进行验证.方法 通过测定样品的病毒滴度,比较滴度结果,筛选最佳覆盖物、覆盖物浓度和病毒孵育时间,从而建立蚀斑法用于测定呼吸道合胞病毒滴度.根据国际人用药品注册技术协调会指导原则和《中华人民共和国药典》要求,验证该方法的准确性、精密性、线性和耐用性.结果 采用0.8％微晶纤维素作为覆盖物,病毒孵育2～3h为建立蚀斑法的最优条件.该蚀斑法测定不同浓度样品病毒滴度的结果相对偏倚均小于10％;试验内和试验间精密性几何变异系数分别为11％和18％;本方法的线性斜率为1.004,相关系数为0.999 1;本方法中固定细胞的时间0.5～24h均适用,差异无统计学意义(F=1.767,P=0.222 5).结论 建立的蚀斑法具有较好的准确性、精密性、线性和耐用性,适用于呼吸道合胞病毒的滴度测定.