目的 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)精制抗原纯度,并进行验证.方法 对样品进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后,使用凝胶成像系统拍照并用Image Lab软件进行分析,获得样品各蛋白条带的光密度值.对建立的方法进行系统适用性、线性、准确度、重复性、中间精密度、灵敏度和耐用性验证.结果 对应 2 套分子量标准蛋白,PT、FHA和PRN精制抗原分别在10.00～50.00 μg/mL的低质量浓度范围和 50.00～600.00 μg/mL的高质量浓度范围内,蛋白浓度和对应条带光密度值之间具有良好的线性关系,相关系数(coefficient of correlation,r)≥0.99.3 种精制抗原杂质水平准确度和重复性回收率均在 80%～120%,且重复性验证相对标准差(relative standard deviation,RSD)≤10%;抗原水平准确度和重复性回收率均在90%～110%,重复性验证RSD≤10%;灵敏度 12.50 μg/mL的回收率均在 80%～120%,RSD≤10%;中间精密度验证RSD≤10%.结论 建立的测定PT、FHA和PRN精制抗原纯度的SDS-PAGE法,其系统适用性、准确度、重复性、中间精密度和灵敏度均良好,可用于以上精制抗原的纯度检测.

目的:观察组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗(DTacP-sIPV)或无细胞百白破-灭活脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTacP-IPV/Hib)基础免疫大鼠后加强免疫破伤风类毒素、降低抗原含量的白喉毒素和无细胞百日咳联合疫苗(Tdap)是否产生免疫加强效果，为候选青少年及成人Tdap疫苗提供临床前研究参考。方法:将自主研发的DTacP-sIPV和已上市的DTacP-IPV/Hib按0、1、2月3剂免疫程序分别免疫Wistar大鼠，检测免疫前和每剂次免疫后各组大鼠血清中各组分抗体水平。基础免疫完成10个月后，用候选Tdap加强免疫1次，并检测加强免疫前和免疫1个月、6个月后血清中各组分抗体水平。结果:3剂次基础免疫1个月后，DTacP-sIPV组抗白喉类毒素(diphtheria toxoid，DT)、抗破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)、抗百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、抗丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)和抗百日咳黏附素(pertactin，PRN)抗体的几何平均滴度(GMT，Log2)分别为17.41、18.34、18.11、19.93、13.91，血清阳转率均达到100%；基础免疫10个月后，抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.17、14.26、13.60、14.51、10.39，血清阳转率维持在89%以上。Tdap加强免疫1个月后，DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA抗体的GMT分别为16.49和17.26、16.80和17.63、16.70和17.74、18.48和19.26，血清阳转率均达到100%，组间差异无统计学意义( P均>0.05)；抗PRN抗体的GMT分别为13.07和11.00，血清阳转率为100%和88%，DTacP-sIPV组高于DTacP-IPV/Hib组( P<0.05)。Tdap加强免疫6个月后，DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.74和14.87、15.07和15.14、14.84和15.73、16.62和16.37、11.44和9.96，血清阳转率维持在88%以上。 结论:候选疫苗Tdap在基础免疫接种DTacP-sIPV和DTacP-IPV/Hib的Wistar大鼠模型加强免疫中可诱导产生良好的体液免疫应答，但抗体滴度随时间推移而衰减。

目的 建立百日咳黏附素(pertactin,PRN)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)检测方法,并进行验证.方法 通过优化检测 PRN抗原WCID-CIEF过程中的聚焦时间、样品终浓度等参数,建立测定PRN抗原的WCID-CIEF方法,并对方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性验证.结果 PRN抗原pI WCID-CIEF测定方法的最佳聚焦时间为1 500 V预聚焦1 min,3 000 V聚焦3 min;体系中PRN抗原最佳终浓度为300 μg/mL.PRN抗原pI约为6.035,样品缓冲液在抗原各峰位置无干扰峰,方法的专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性均良好.结论 建立的WCID-CIEF方法适用于PRN抗原的pI检测及电荷异质性分析,可为PRN抗原的表征提供依据以及相关疫苗研发和生产过程中的质量控制提供参考.

目的:建立适合大规模生产的组分无细胞百日咳疫苗(acellular component pertussis vaccine,ACPV)纯化新工艺,从百日咳杆菌发酵液中分离纯化百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)3种抗原组分.方法:百日咳杆菌发酵液经离心分离上清和菌体,上清通过超滤浓缩后,经多模式阳离子交换介质Eshmuno(R) HCX和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PT;菌体经高盐缓冲液浸提后离心,浸提上清经阳离子交换介质Capto SP ImpRes和羟基磷灰石介质CHT两步层析获得FHA;浸提沉淀采用尿素抽提和硫酸铵盐析后,经复合型阴离子交换介质Capto Adhere和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PRN.采用该工艺连续生产3批ACPV,检测各项指标,验证该工艺的重复性.结果:经该工艺得到的3种抗原组分完整性好且纯度均在95％以上,层析工艺平均回收率可达60％以上,FHA和PRN抗原均可通过特异性毒性检查;建立的纯化新工艺具有良好的重复性.结论:采用柱层析方法从百日咳杆菌培养物中分离纯化出了3种高纯度的百日咳抗原成分(PT,FHA和PRN),该方法适用于大规模生产,为以组分百白破疫苗为基础的联合疫苗的研发奠定基础.

无细胞百日咳疫苗接种后的免疫持久性下降和百日咳杆菌变异是导致"百日咳再现"的两个重要原因.百日咳杆菌变异株不表达无细胞百日咳疫苗中所包含的抗原成分,其中以黏附素蛋白的缺失最为常见.大量研究表明黏附素蛋白的缺失对百日咳杆菌的侵袭力和致病性并无明显影响,被认为可以由其他毒力因子代偿.黏附素蛋白缺失株产生的原因,包括IS481序列插入等菌株自身变异相关的分子机制,以及无细胞百日咳疫苗接种后的免疫环境造成的选择性压力.我国目前处在无细胞百日咳疫苗接种初期,尚未报道发现黏附素蛋白缺失株.

目的 建立组分无细胞百白破联合疫苗(DTaP)纯度分析的分子排阻高效液相色谱(SE-HPLC)方法,用于疫苗生产过程的质量检测指标.方法 建立SE-HPLC法检测DTaP中破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、百日咳毒素(PT)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳黏附素(PRN)五种组分纯化液和TT脱毒液纯度的方法,同时用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法对各组分纯度进行对比检测和分析.结果 选TSK-GEL G4000PWxL色谱柱,DTaP组分的SE-HPLC法纯度检测和分析显示,PT、FHA、PRN、DT纯化液的平均纯度分别为98.46％、91.88％、94.16％、90.11％;TT纯化液二聚体、单体的含量分别占74.50％、25.50％,TT脱毒液二聚体、单体的含量分别占57.22％、42.78％.上述结果与SDS-PAGE法的检测和分析结果相似.结论 SE-HPLC法可以用于DTaP五种纯化液的纯度分析,其与SDS-PAGE法都可以对DTaP生产过程中的纯度指标进行监控.

目的 使用A、B、C 3组酶联免疫吸附试验(ELISA)系统进行百日咳疫苗临床血清检测,每组ELISA系统包括至少一种百日咳毒素(PT)、一种丝状血凝素(FHA)和一种黏附素(PRN)包被抗原,其中C组抗原包括2种FHA抗原,酶标二抗是相同的抗人IgG抗体.比较不同包被抗原对百日咳疫苗临床血清中3种IgG抗体检测结果的影响.方法 收集164对无细胞百日咳、白喉和破伤风疫苗基础免疫前、免疫后临床血清,使用ELISA法检测和计算血清百日咳IgG抗体的转阳率和单位值.使用χ2检验比较转阳率差异,使用方差分析比较抗体检测结果.结果 A组抗原检测IgG抗体结果为PT 82.19 IU/mL,FHA 81.66 IU/mL,PRN 39.34 IU/mL;转阳率均为100.0％.B组抗原检测结果为PT 95.59 IU/mL,FHA 57.39 IU/mL,PRN 40.76 IU/mL;转阳率PT抗体为99.4％,其余为100.0％.C组抗原检测结果为PT 60.74 IU/mL,2种FHA分别为29.33 IU/mL和53.32 IU/mL,PRN 34.05 IU/mL,转阳率为99.4％、95.1％、100.0％和98.8％.3组抗原检测的临床血清转阳率经χ2检验FHA差异有统计学意义(P<0.05),PT和PRN差异无统计学意义(P>0.05);抗体GMC经方差分析,所有组抗原检测3个抗体值之间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 本次人临床血清抗体转阳率和抗体值达到保护力水平,但是不同抗原检测系统之间差异均有统计学意义,应尽快建立百日咳抗血清IgG检测用抗原试剂国家参考品.

目的 建立定量分析以组分百白破疫苗为基础的联合疫苗中百日咳鲍特氏菌气管细胞毒素(tracheal cytotoxin,TCT)的液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法,并进行验证及初步应用.方法 HPLC条件:色谱柱BioC18,流动相A为0.1％甲酸水溶液(V/V),流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液(V/V),进样量为5 μL,柱温为30℃,流速为0.3 mL/min;MS条件:电喷雾离子源正电子模式,电压为3.0 KV,离子源温度为300℃,脱溶剂管温度为250℃,雾化器流速为3 L/min,干燥气流速为10 L/min,采用多反应监测模式(multi reaction monitoring mode,MRM)检测TCT.验证方法的线性范围、灵敏度、精密度及准确度.采用该方法对国内外公司生产的组分百白破联合疫苗33批成品、63批原液、80批纯化蛋白进行TCT筛查及定量分析.结果 TCT标准溶液在20.66～661 ng/L范围内,与TCT的定量高子通道922.3＞719.3峰面积线性良好,线性方程为Y=3 555.9 X-3 368,R2=0.996;检出限为2.58 ng/L,定量限为10.33 ng/L;20.65、82.625及330.5 ng/LTCT标准溶液重复检测5次TCT峰面积的RSD分别为2.23％、4.61％和4.40％;66.1及33.05 ng/L的加标样品回收率分别为104.1％和94.4％.所有组分百日咳联合疫苗成品及原液样品均无TCT检出,纯化蛋白样品仅有一家公司的1批黏附素(pertactin,PRN)蛋白的裂解菌体浓缩液检出65.5 ng/LTCT,其后序工艺样品均未检出.结论 成功建立了定量分析组分百白破联合疫苗中TCT的LC-MS/MS方法,该方法灵敏度高,准确度、精密度及线性良好,可用于我国组分百白破联合疫苗的TCT定量定性检测.

目的:建立百日咳毒素、百日咳丝状血凝素、百日咳黏附素3种抗原含量检测方法,用于组分百日咳疫苗吸附原液的检测.方法:制备抗百日咳毒素、抗百日咳丝状血凝素和抗百日咳黏附素3种兔多克隆抗体,利用棋盘滴定法确定检测条件,建立双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法),并进行方法学的验证.结果:3种酶联免疫吸附法的线性相关良好(R2＞ 0.98),线性检测范围分别为1.25 ～20,2.5 ～40,0.625 ～ 10ng· mL-;该方法的检测准确度高(回收率均在95％～115％),精密度良好(CV＜10％).结论:本研究建立了百日咳系列抗原的酶联免疫吸附法,可用于组分百日咳吸附原液解吸附方法及吸附原液稳定性的研究.

目的 利用小鼠百日咳感染模型评估在无细胞百日咳疫苗中加入腺苷酸环化酶毒素的C端结构域(RTX751),能否提升无细胞百日咳疫苗的免疫保护效果.方法 ①用腺苷酸环化酶毒素的C端结构域与百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)、百日咳黏附素(pertussis adhesin,PRN)、氢氧化铝(aluminum hydroxide,Alum)佐剂制备成试验疫苗,对C57BL/6小鼠行腹腔两针免疫.②第2针免疫后21 d,用浓度为1×1011 CPU/mL的百日咳鲍特菌对小鼠进行气雾攻毒.攻毒后分别在3、7、14、28 d进行取样分析.③分析第2次免疫后IgG抗体水平和IgG1/IgG2a比例变化及感染百日咳鲍特菌后不同时间点呼吸道组织细菌载量和细胞因子IFN-γ、IL-17的变化.结果 1/40aP+RTX和1/80aP+RTX的IgG抗体水平高于1/40aP和1/80aP,差异有统计学意义(P＜0.05),1/80aP+RTX的IgG2a/IgG1高于1/80 aP,差异有统计学意义(P＜0.05);攻毒后14 d,1/80aP+RTX组肺细菌菌落数最少、气管细菌已清除完毕,IFN-γ、IL-17细胞因子分泌量最低,与Alum组相比差异有统计学意义(P＜0.05);Alum组与RTX751组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 单独的RTX751不能作为保护性抗原;但在小鼠模型中,RTX751加入到无细胞百日咳疫苗可使免疫应答向Th1偏向去增强无细胞百日咳疫苗的免疫保护效果.