目的 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)精制抗原纯度,并进行验证.方法 对样品进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后,使用凝胶成像系统拍照并用Image Lab软件进行分析,获得样品各蛋白条带的光密度值.对建立的方法进行系统适用性、线性、准确度、重复性、中间精密度、灵敏度和耐用性验证.结果 对应 2 套分子量标准蛋白,PT、FHA和PRN精制抗原分别在10.00～50.00 μg/mL的低质量浓度范围和 50.00～600.00 μg/mL的高质量浓度范围内,蛋白浓度和对应条带光密度值之间具有良好的线性关系,相关系数(coefficient of correlation,r)≥0.99.3 种精制抗原杂质水平准确度和重复性回收率均在 80%～120%,且重复性验证相对标准差(relative standard deviation,RSD)≤10%;抗原水平准确度和重复性回收率均在90%～110%,重复性验证RSD≤10%;灵敏度 12.50 μg/mL的回收率均在 80%～120%,RSD≤10%;中间精密度验证RSD≤10%.结论 建立的测定PT、FHA和PRN精制抗原纯度的SDS-PAGE法,其系统适用性、准确度、重复性、中间精密度和灵敏度均良好,可用于以上精制抗原的纯度检测.

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

目的:构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因（CPI502/GAPDH720）真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720，并观察其在人宫颈癌细胞（Hela细胞）中的蛋白表达。方法:根据T细胞表位预测的基因序列设计引物，以质粒pGEM-T-CPI621为模版，利用反转录PCR（RT-PCR）扩增目的基因片段，将该片段克隆至原核表达质粒pET-28a（+）中，构建原核表达质粒pET28a（+）-BmCPI502。根据软件设计合适引物，RT-PCR分别扩增BmCPI502基因和BmGAPDH720基因，pcDNA3.1（+）、BmCPI502、BmGAPDH720分别进行双酶切后进行连接，构建复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720。将复合表位基因重组质粒转染至Hela细胞后，进行RT-PCR验证，获得与预期相符目的条带；将表达产物利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测。结果:获得了原核表达重组质粒pET28a（+）-BmCPI502，经酶切鉴定得到502 bp特异性片段，与预期值符合；成功构建了复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720，酶切鉴定所产生的片段大小与预期符合；复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720转染Hela细胞后得到稳定表达，SDS-PAGE鉴定分析显示重组蛋白相对分子质量（ Mr × 10 3）约为50。 结论:成功构建了周期型马来丝虫复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）-BmCPI502/BmGAPDH720，并在真核细胞中获得相应的重组蛋白，为进一步研究重组蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。

目的:制备一种针对整合素αM(CD11b)受体的预定位分子探针 68Ga-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酸-精氨酸-谷氨酸-十一聚乙二醇-1，2，4，5-四嗪/CD11b抗体片段-反式-环辛烯[ 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz/anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO]，并通过microPET显像探讨其作为CD11b受体靶向分子探针的可行性。 方法:采用免疫荧光法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7膜表面CD11b受体的表达情况。将CD11b抗体与TCO连接，并通过酶切法得到anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO。对配体NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz进行 68Ga标记，检测标记率以及放化纯。进行预定位细胞结合实验，建立CT26结肠癌荷瘤裸鼠模型，进行预定位生物分布以及microPET显像实验。用免疫组织化学检查验证肿瘤微环境中CD11b +细胞的浸润情况。用单因素方差分析比较组间差异。 结果:免疫荧光检测结果显示RAW264.7细胞膜表面高度表达CD11b受体。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证成功合成anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO。放射性配体 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz标记率约为94.6%，比活度为7.0~7.4 MBq/μg，放化纯大于95%。预定位细胞结合实验证实该分子探针与CD11b受体有较好的靶向性。生物分布及显像结果示，在预定位4、12以及24 h时间间隔下，模型鼠肾放射性摄取较高，表明分子探针通过肾代谢；肿瘤/肌肉比值为9.23±1.45、12.53±1.36和10.74±1.11( F＝848.8， P<0.05)；在预定位12 h注射放射性配体后1 h显像，肿瘤与非靶器官对比度最佳：肿瘤标准摄取值(SUV)为0.67±0.12，肌肉SUV为0.09±0.04。免疫组织化学结果示，CT26结肠癌微环境中浸润了大量CD11b +细胞。 结论:成功合成预定位分子探针 68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG 11-Tz/anti-CD11b-F(ab′) 2-TCO，该标记物对CD11b阳性结肠癌具有较强的靶向能力，有望用于靶向CD11b受体的体内示踪。

目的:构建粪肠球菌（Efs）介导的日本血吸虫（Sj）重组疫苗（rEfs-Sj26GST疫苗），并研究Sj26GST-GST融合蛋白在重组疫苗中的表达情况。方法:将pGEX-Sj26GST重组质粒电穿孔转化Efs ATCC47077株感受态，构建rEfs-Sj26GST疫苗，提取质粒进行PCR鉴定；经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）对表达产物进行分析和鉴定。结果:经PCR鉴定，扩增出大小约676 bp的片段，与Sj26GST扩增片段长度相符。经SDS-PAGE分析，得到相对分子质量约52 × 10 3的条带，与Sj26GST-GST融合蛋白条带相符。Western blot结果显示，rEfs-Sj26GST疫苗表达的Sj26GST-GST融合蛋白可被Sj感染者血清特异性识别。 结论:成功构建了rEfs-Sj26GST疫苗，Sj感染者血清可特异性识别重组疫苗表达的Sj26GST-GST融合蛋白。

目的:构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白，为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法:以细粒棘球蚴cDNA为模板，利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因，经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中，构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达大量蛋白，采用亲和层析方法纯化重组蛋白；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白纯化水平，蛋白免疫印迹（Western blot）法鉴定表达产物。 结果:成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒，诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15 × 10 3处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带，且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示，纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。 结论:成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白，为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。

目的:制备抗B组柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CVB)3C蛋白的多克隆抗体。方法:通过聚合酶链式反应从pcDNA3.1(+)-EGFP-3C中扩增编码3C的DNA片段，构建pET28a(+)-3C-6His表达载体，转化至大肠埃希菌(Escherichia coli， E. Coli)BL21(DE3)以表达3C重组蛋白。优化表达条件及菌体蛋白的提取方法，经超声破碎制备菌体总蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后，用氯化钾进行胶染色，切胶回收相对分子质量为26 000的蛋白，即纯化的3C重组蛋白(3C-6His的相对分子质量为26 000)。用纯化的1 mg 3C重组蛋白加等量弗氏佐剂免疫新西兰大白兔，共免疫5次，每次间隔1周，免疫结束后1周取兔血清，检测抗体的特异性。 结果:在相对分子质量为26 000的位置检测到了3C-6His融合蛋白的表达，成功构建了高效表达带His标签的3C重组蛋白载体。重组3C蛋白原核优化表达条件为37 ℃培养细菌6 h，加0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)进行诱导。经SDS-PAGE分离菌体总蛋白，得到了纯化的3C重组蛋白。获得的兔免疫血清可以结合 E. Coli及HeLa细胞表达的3C蛋白，还能识别感染CVB3或肠道病毒A71的HeLa细胞中表达的3C蛋白。 结论:获得了抗CVB3 3C蛋白酶的多克隆抗体，这一抗体可特异结合肠道病毒的3C蛋白酶，为进一步研究3C蛋白酶在肠道病毒致病机制中的作用奠定了基础。

目的:通过蛋白重组技术低成本、快速制备高浓度人视黄醇结合蛋白4（hRBP4）参考物质，解决临床hRBP4高值参考物质难以获取的需求。方法:在美国国立生物技术信息中心NCB查找hRBP4的互补DNA序列，经大肠埃希菌密码子优化后人工合成，然后将DNA片段克隆至原核表达质粒pET-28a（+）中，以构建重组hRBP4表达载体。将重组质粒转化至 E. coli BL21感受肽中，优化诱导表达条件（如温度、转速和异丙基硫代半乳糖苷IPTG浓度等）、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化，获取纯化后的hRBP4重组蛋白。 结果:DNAMAN软件对比显示编码hRBP4蛋白的碱基序列完全正确，成功构建重组hRBP4原核表达质粒；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示亲和纯化产物中可清晰可见约相对分子质量26 000电泳条带；临床尿液和血清hRBP4常规检测系统均可检测到纯化的hRBP4蛋白，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系。结论:成功构建重组hRBP4高水平表达系统，重组hRBP4蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有望在室间质量评价质控品和有证参考物质研制中发挥重要作用。

目的:探讨不同粒径大小对γ辐照中脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）中胶原结构的影响以及辐照保护剂的有效性。方法:取同一供体的冻干皮质骨，依据Urist改良法制备不同粒径的（0.5~1.0 mm、1.2~2.8 mm、3.3~4.7 mm及5.7~7.0 mm）DBM样品，按照不同剂量分为：0 kGy、15 kGy、25 kGy及25 kGy（辐照保护剂），真空密封后储存于-80℃冰箱待用。通过扫描电镜观察胶原表面形态，大体观察胶原表面结构损伤的程度；将样品按照0.2 g/ml生理盐水比例在50℃条件下72 h，利用浸提液颜色深度观察胶原被辐照损伤的程度；使用2，4-二硝基苯肼（吸光光度计法）测定样品中羰基含量；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺钠凝胶电泳法（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）测定样品中胶原分子量的变化；利用差示热量扫描法（differential scanning calorimetry，DSC）检测样品热变性温度以观察胶原热稳定性。结果:样品浸提液颜色与γ辐照剂量相关度较高，未辐照样品浸提液颜色清亮，而在同粒径下随辐照剂量加大浸提液黄色逐渐加深，5.7~7.0 mm粒径组颜色相对较浅；25 kGy组相比于25 kGy+保护剂组浸提液颜色加深。扫描电镜观察到γ辐照导致胶原结构紊乱，纤维断裂，随着辐照剂量增大损伤区域增多，当粒径增大时，损伤区域有减少的趋势；相比于25 kGy组，25 kGy+保护剂组胶原结构性破坏减少。差示热量扫描法得出样品热交换曲线，随着粒径增大，热变性温度有增高的趋势，粒径间对比有统计学差异（ F=189.4， P<0.001）；同粒径间差异不明显。SDS-PAGE发现同粒径下γ辐照剂量愈大，胶原分子量愈小；同辐照条件下随粒径较小，高分子量胶原含量减少明显；225 kGy+保护剂组相比于25 kGy组，高分子量增多。羰基含量结果显示在同一粒径下，γ辐照使羰基含量增多，0.5~1.0 mm组（ F=13.631， P=0.002），1.2~2.8 mm组（ F=6.390， P=0.016），3.3~4.7 mm组（ F=5.630， P=0.023），5.7~7.0 mm组（ F=4.150， P=0.048）的差异均有统计学意义，不同粒径间随着粒径增大羰基含量逐渐减小但差异统计学意义（ F=0.560， P=0.650）。 结论:γ辐照与胶原的氧化损伤具有明显的剂量反应关系，随着γ辐照剂量的增加，胶原损伤程度逐渐增加；DBM的粒径大小影响着胶原对γ辐照的敏感度，随着粒径的减小，DBM颗粒更易被γ辐照损伤；辐照保护剂在辐照过程中对胶原有一定程度的保护作用。

目的:制备抗白细胞介素1β（IL-1β）纳米抗体，并观察其对缺氧小鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:利用DNA重组技术，使用pET-16b和pHEN1表达载体构建抗IL-1β纳米抗体的重组质粒（pET-16b-4G6M-VHH、pET-16b-5BVP-VHH、pET-16b-5MVZ-VHH和pHEN1-4G6M-VHH、pHEN1-5BVP-VHH、pHEN1-5MVZ-VHH，其中VHH为重链单域抗体，4G6M-VHH、5BVP-VHH、5MVZ-VHH分别为3种抗IL-1β的纳米抗体），将构建成功的质粒分别转入大肠杆菌Rosetta2（DE3）表达菌中进行诱导表达及镍柱纯化，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹对表达产物及纯化产物进行鉴定，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其亲和力。将纯化所得亲和力最高的抗IL-1β纳米抗体（pHEN1-5MVZ-VHH）应用于小鼠HL-1心肌细胞缺氧模型（分为正常对照组、缺氧模型组、空白质粒组及12.5、25.0、50.0 μg/ml pHEN1-5MVZ-VHH处理组），并检测细胞存活率及凋亡率。结果:SDS-PAGE和Western印迹结果显示，成功得到相对分子质量约15 000的抗IL-1β纳米抗体；ELISA结果显示，与pET-16b载体组相比，pHEN1载体组所表达的纳米抗体与IL-1β抗原的亲和力更高（4G6M-VHH组：3.20±0.03比1.20±0.03， P<0.001；5BVP-VHH组：3.18±0.06比1.21±0.02， P<0.001；5MVZ-VHH组：3.38±0.05比1.62±0.04， P<0.001）；细胞存活及凋亡检测结果显示，与缺氧模型组相比，25.0 μg/ml及50.0 μg/ml pHEN1-5MVZ-VHH处理组HL-1细胞活性增加［（75.55±2.23）%比（46.90±2.51）%， P<0.001；（74.36±1.96）%比（46.90±2.51）%， P<0.001］，凋亡率降低［（6.83±0.27）%比（10.24±0.76）%， P<0.001；（6.68±0.38）%比（10.24±0.76）%， P<0.001］。 结论:pET-16b和pHEN1载体均能表达出抗IL-1β纳米抗体，且pHEN1载体表达的纳米抗体具有更好的抗原亲和作用。此外，pHEN1-5MVZ-VHH治疗可减少缺氧小鼠心肌细胞凋亡。