目的 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)精制抗原纯度,并进行验证.方法 对样品进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后,使用凝胶成像系统拍照并用Image Lab软件进行分析,获得样品各蛋白条带的光密度值.对建立的方法进行系统适用性、线性、准确度、重复性、中间精密度、灵敏度和耐用性验证.结果 对应 2 套分子量标准蛋白,PT、FHA和PRN精制抗原分别在10.00～50.00 μg/mL的低质量浓度范围和 50.00～600.00 μg/mL的高质量浓度范围内,蛋白浓度和对应条带光密度值之间具有良好的线性关系,相关系数(coefficient of correlation,r)≥0.99.3 种精制抗原杂质水平准确度和重复性回收率均在 80%～120%,且重复性验证相对标准差(relative standard deviation,RSD)≤10%;抗原水平准确度和重复性回收率均在90%～110%,重复性验证RSD≤10%;灵敏度 12.50 μg/mL的回收率均在 80%～120%,RSD≤10%;中间精密度验证RSD≤10%.结论 建立的测定PT、FHA和PRN精制抗原纯度的SDS-PAGE法,其系统适用性、准确度、重复性、中间精密度和灵敏度均良好,可用于以上精制抗原的纯度检测.

目的:观察组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗(DTacP-sIPV)或无细胞百白破-灭活脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTacP-IPV/Hib)基础免疫大鼠后加强免疫破伤风类毒素、降低抗原含量的白喉毒素和无细胞百日咳联合疫苗(Tdap)是否产生免疫加强效果，为候选青少年及成人Tdap疫苗提供临床前研究参考。方法:将自主研发的DTacP-sIPV和已上市的DTacP-IPV/Hib按0、1、2月3剂免疫程序分别免疫Wistar大鼠，检测免疫前和每剂次免疫后各组大鼠血清中各组分抗体水平。基础免疫完成10个月后，用候选Tdap加强免疫1次，并检测加强免疫前和免疫1个月、6个月后血清中各组分抗体水平。结果:3剂次基础免疫1个月后，DTacP-sIPV组抗白喉类毒素(diphtheria toxoid，DT)、抗破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)、抗百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、抗丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)和抗百日咳黏附素(pertactin，PRN)抗体的几何平均滴度(GMT，Log2)分别为17.41、18.34、18.11、19.93、13.91，血清阳转率均达到100%；基础免疫10个月后，抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.17、14.26、13.60、14.51、10.39，血清阳转率维持在89%以上。Tdap加强免疫1个月后，DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA抗体的GMT分别为16.49和17.26、16.80和17.63、16.70和17.74、18.48和19.26，血清阳转率均达到100%，组间差异无统计学意义( P均>0.05)；抗PRN抗体的GMT分别为13.07和11.00，血清阳转率为100%和88%，DTacP-sIPV组高于DTacP-IPV/Hib组( P<0.05)。Tdap加强免疫6个月后，DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.74和14.87、15.07和15.14、14.84和15.73、16.62和16.37、11.44和9.96，血清阳转率维持在88%以上。 结论:候选疫苗Tdap在基础免疫接种DTacP-sIPV和DTacP-IPV/Hib的Wistar大鼠模型加强免疫中可诱导产生良好的体液免疫应答，但抗体滴度随时间推移而衰减。

目的 制备百日咳毒素(pertussis toxin,PT)兔多克隆抗体(简称多抗),建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并进行验证及应用.方法 采用传统方法,用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗.优化ELISA系统反应条件,建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法,并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证.采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白(fimbriae proteins,FIM)原液中PT抗原含量进行检测.结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1 μg/mL,酶标抗体稀释度为1∶8 000.此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应,而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400ng/mL之间;PT高、中、低浓度回收率分别为103.27％、91.48％、103.52％;酶标板内和板间的变异系数(CV)均小于10％;该方法的灵敏度为20.719 ng/mL,检测下限为41.438 ng/mL.检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取样时间点的35批样品,其抗原含量变化均符合脱毒反应变化趋势.结论 成功制备了PT兔多抗,并建立了精密性和准确性良好的定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,可用于组分百白破联合疫苗生产过程中化学脱毒样品的抗原含量检测.

目的 对吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株的主要保护性抗原基因序列遗传稳定性及理化性质稳定性进行研究,为无细胞百白破疫苗的安全性和有效性提供依据.方法 分别从百日咳、白喉和破伤风疫苗生产用菌株的主代、工作代、疫苗生产用工作种子(P1)、P2、P3(P1后再传2代)的菌体全基因组DNA中,扩增出百日咳主要抗原组分[百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、外膜蛋白(pertactin,PRN)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)]、白喉主要抗原[白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)原液]、破伤风主要抗原[破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)原液]的基因序列,克隆至pLB-Simple Vector,转化E.coli DH5α,测序后,运用DNAMAN软件与GenBank中登录的相应序列进行比对和分析.按照《中国药典》三部(2015版)相关方法,进行菌株理化性质稳定性检测.结果 生产用百日咳、白喉、破伤风菌株的主代、工作代、P1、P2、P3的主要抗原基因序列大小及同源性与预期一致,理化性质稳定.结论 吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株的主要保护性抗原基因序列遗传稳定,理化性质稳定.

目的 确定百日咳杆菌无动物源培养基最佳配方,并检测其对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)产量的影响.方法 分别按一定比例混合使用或单独使用无动物源蛋白HyPep5603(小米和小麦蛋白)、精选大豆胨,替代培养基中动物源性成分(酸水解酪蛋白)作为氮源,进行百日咳杆菌摇瓶培养,比较细菌生长密度和产物生产量.以最高PT和FHA产量为参考标准,确定最佳培养基配方.用该配方与动物源培养基对比,进行4批30 L百日咳杆菌发酵培养;发酵液处理后,用离子交换层析分离PT和FHA样品,ELISA法测定各样品中PT和FHA的蛋白含量,SDS-PAGE法检测产物的相对分子质量大小.结果 由无动物氮源HyPep56034.0g/L、精选大豆胨6.0g/L加改良SS培养基组成的培养基,摇瓶培养百日咳杆菌后最高A550为3.8,发酵百日咳杆菌后最高A550为5.8,均能有效地供菌体生长,且优于单独使朋动物源或无动物源培养基;用该配方发酵百日咳杆菌并纯化,获得PT的产量约为5.7 mg/L,FHA产量约为23.0 mg/L,均高于用动物源培养基培养后的产物,且相对分子质量大小一致.结论 用含HyPep5603 4.0 g/L、精选大豆胨6.0g/L的无动物源培养基培养百日咳杆菌,可替代动物源培养基,用于PT和FHA的生产.

目的 从百日咳鲍特菌中提纯百日咳丝状血凝素( filamentous hemagglutinin,FHA),并对其进行初步鉴定.方法采用珍珠岩吸附层析和羟基磷灰石吸附层析相结合的方法,从百日咳鲍特菌培养上清中纯化FHA;SDSPAGE电泳和PAGE电泳分析样品纯度,并经斑点免疫印迹法对其进行鉴定.结果纯化样品的纯度达到95％以上,斑点免疫印迹中和FHA单抗有反应斑点,与百日咳毒素( pertussis toxin,PT) 单抗无反应斑点.结论珍珠岩吸附层析和羟基磷灰石吸附层析相结合的方法可作为一种快速有效的纯化手段提取纯度较高的FHA,有望作为参考品用于百日咳FHA抗原含量检测、抗FHA血清抗体滴度检测及抗原纯度检测.

目的 探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题.方法 选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经CaptoSP InpRes柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析.结果 使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下.在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势.结论 使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究.

[背景]无细胞组分百日咳疫苗在人群中接种后不良反应发生率大大降低,是未来百日咳疫苗的发展方向,但是新的抗原纯化方式需要工艺中加入内毒素的去除.[目的]使用响应面法优化层析纯化法去除无细胞百日咳疫苗中百日咳丝状血凝素(Filamentous hemagglutinin,FHA)中内毒素的工艺.[方法]通过单因素试验,确定响应面设计范围;根据响应面法设计原理,使用MiniTAB软件,以FHA的回收率和收获的FHA蛋白浓度,同时兼内毒素合格为考察指标,对上样样品量、样品pH、样品电导Cond进行优化,最终确定去除FHA内毒素的层析纯化工艺.[结果]使用目前的层析纯化条件获得的Capto adhere去除FHA的内毒素的最佳工艺条件:pH 5.3,Cond 9.6,Mass 3.0.[结论]用响应面法优化了去除百日咳丝状血凝素中内毒素的层析纯化工艺,这种方法效率高、耗时少,为后续生物制品工艺扩大再生产提供参考.

目的 研究不同氢氧化铝佐剂含量、两种吸附方式以及不同厂家氢氧化铝佐剂对无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗(DTaP-sIPV)免疫效果的影响.方法 用0.42 mg/ml、0.47 mg/ml、0.52 mg/ml终浓度的铝吸附相同剂量的百白破5种抗原,用顺序吸附和分别吸附两种方式吸附抗原,使用进口和自制氢氧化铝,比较各抗原的吸附率、各抗原抗体水平以及百日咳、破伤风、白喉疫苗效价.结果 0.52 mg/ml铝含量组吸附率最高,0.42 mg/ml铝含量组吸附率最低;顺序吸附和分别吸附两种吸附方式没有明显差异;使用进口氢氧化铝佐剂和自制氢氧化铝佐剂组分抗体反应各有不同,差异无统计学意义.结论 0.52 mg/ml铝含量、自制氢氧化铝佐剂和分别吸附的方式适用于DTaP-sIPV疫苗的制备.

目的:建立适合大规模生产的组分无细胞百日咳疫苗(acellular component pertussis vaccine,ACPV)纯化新工艺,从百日咳杆菌发酵液中分离纯化百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)3种抗原组分.方法:百日咳杆菌发酵液经离心分离上清和菌体,上清通过超滤浓缩后,经多模式阳离子交换介质Eshmuno(R) HCX和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PT;菌体经高盐缓冲液浸提后离心,浸提上清经阳离子交换介质Capto SP ImpRes和羟基磷灰石介质CHT两步层析获得FHA;浸提沉淀采用尿素抽提和硫酸铵盐析后,经复合型阴离子交换介质Capto Adhere和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PRN.采用该工艺连续生产3批ACPV,检测各项指标,验证该工艺的重复性.结果:经该工艺得到的3种抗原组分完整性好且纯度均在95％以上,层析工艺平均回收率可达60％以上,FHA和PRN抗原均可通过特异性毒性检查;建立的纯化新工艺具有良好的重复性.结论:采用柱层析方法从百日咳杆菌培养物中分离纯化出了3种高纯度的百日咳抗原成分(PT,FHA和PRN),该方法适用于大规模生产,为以组分百白破疫苗为基础的联合疫苗的研发奠定基础.