目的 建立针对聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化重组人源化抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)抗体(PEG-抗TNFα单抗)的关键质量属性质控方法.方法 采用肽图谱鉴别PEG-抗TNFα单抗,分子排阻高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法检测分子大小异质性,阳离子交换高效液相色谱(cation exchange-high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法检测电荷异质性,反相超高效液相色谱(reversed-phase-ultra performance liquid chromatography,RP-UPLC)法检测 PEG残留量及错配异构体含量;利用稳定转染TNFα相关受体下游反应元件驱动的报告基因的HEK293细胞测定生物学活性.结果 PEG-抗TNFα单抗具有相应的特征图谱,可用于鉴别;SEC-HPLC单体峰相对百分含量为(99.66±0.01)％,高分子量物质峰相对百分含量为(0.31±0.01)％,低分子量物质均低于定量限;CEX-HPLC主峰区峰相对百分含量为(98.31±0.10)％,酸性峰区峰相对百分含量为(1.31±0.04)％,碱性峰区峰相对百分含量为(0.38±0.07)％;PEG含量低于定量限,错配异构体含量为(0.76±0.007)％;生物学活性的半数最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)值为(2.22±0.11)ng/mL.结论 针对PEG-抗TNFα单抗的关键质量属性建立了相应的质量控制方法,可确保其安全、有效及质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供了参考.

目的:研究并建立针对抗淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)单克隆抗体的关键质量属性质量控制方法.方法:基于胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行肽指纹图谱分析,分子排阻色谱法(SE-HPLC)进行单体聚体纯度分析,采用还原/非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳法(CE-SDS)进行大小变异体纯度分析,采用阳离子色谱法(CEX-HPLC)进行电荷变异体纯度分析,采用HILIC-UPLC法进行寡糖分析,采用ELISA法测定Aβ抗原相对结合活性.其他各项指标均应符合《中华人民共和国药典》2020年版以及其他相关要求.结果:肽指纹图谱起到良好的鉴别作用;SE-HPLC法中单体相对百分含量为(99.40±0.00)％,聚体的相对百分含量为(0.55±0.00)％;还原CE-SDS法中轻重链之和的相对百分含量为(98.11±0.08)％,非还原CE-SDS法的主峰相对百分含量为(96.57±0.15)％,HHL峰相对百分含量为(1.91±0.10)％;CEX-HPLC法中主成分相对百分含量为(75.08±0.06)％,酸性变异体的相对百分含量为(16.12±0.05)％,碱性变异体的相对百分含量为(8.80±0.05)％;HILIC-UPLC寡糖图谱分析的(G0F+G1F+G2F),Man5,G0 相对百分含量分别为(91.56±0.04)％,(1.21±0.03)％,(2.60±0.01)％;ELISA 法中与 Aβ 抗原的相对结合活性为(101.40±0.53)％.结论:针对抗Aβ单抗的质量属性,研究建立质控方法并进行质量研究,确保产品安全有效和质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供参考依据.

目的 构建卡那霉素抗性的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antago-nist,rhIL-1Ra)菌 种,并进行rhIL-IRa蛋白的表达、纯化及质量鉴定,以降低β-内酰胺抗生素带来的风险.方法 分别以氨苄抗性的质粒rhIL-1Ra(A-rhIL-1Ra)、pET-28a为模板,进行PCR扩增,获得线性化载体和卡那霉素基因片段,经同源重组构建卡那霉素抗性的质粒rhIL-1Ra(K-rhIL-1Ra),测序正确后转化E.coli BL21(DE3),构建重组工程菌,经IPTG诱导表达后,进行CM Bestarose Fast Flow、DEAE Bestarose Fast Flow两步柱层析纯化.收集纯化产物,15％SDS-PAGE、分子排阻高效液相色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、反相高效液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测纯度,串联质谱法检测质谱相对分子质量,Western blot法鉴定特异性,报告基因法检测生物学活性,液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)法分析比对产品相关杂质.结果 经菌落PCR及测序鉴定证明质粒K-rhIL-1Ra构建正确.表达的K-rhIL-1Ra蛋白相对分子质量约17 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的30％以上;两步纯化的K-rhIL-1Ra蛋白纯度分别为97％和99％,单体含量分别为99.33％和100％,色谱纯度分别为91.86％和96.96％,质谱相对分子质量与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致,可与小鼠抗人IL-1Ra单抗发生特异性反应;纯化的K-rhIL-1Ra蛋白生物学活性为1.29 × 105U/mg,相关蛋白化学修饰类型与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致.结论 成功构建了 K-rhIL-1Ra菌种,表达并纯化后的蛋白符合rhIL-1Ra的特征和质量标准,为rhIL-1Ra菌种变更及可比性研究奠定了基础.

目的:探讨鼠李糖(rhamnose,Rha)修饰对曲妥珠单抗(trastuzumab,Tra)Fc效应功能的影响.方法:将二硫键还原的Tra分子与含交联剂的Rha衍生物分子偶联,构建Tra-Rha偶联物.使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和高效液相分子排阻色谱对偶联物进行表征,并通过流式细胞术评估偶联物的HER2抗原亲和水平,免疫荧光和流式细胞术评估偶联物的抗Rha抗体募集能力.最后,通过在体外检测偶联物介导的补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖细胞介导的吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP),评估其Fc效应功能的增强水平.结果:成功构建了一款Tra-Rha偶联物.亲和实验和抗体募集实验表明Tra-Rha偶联物保留了良好的HER2抗原结合能力,并能将高水平抗Rha抗体选择性募集至靶细胞表面.CDC实验显示,Tra-Rha偶联物可介导显著的CDC效应对HER2阳性的SKBR3和SKOV3细胞进行杀伤,最高杀伤率分别为75％和70％,而相同条件下未修饰Rha的Tra则不能介导CDC.ADCP实验则显示,在SKBR3和SKOV3细胞中,Tra-Rha介导的ADCP水平较Tra分别提高了 2.3倍和1.2倍.结论:Rha修饰可作为一种经济高效的策略,用于同时增强Tra的多种Fc效应功能,进而改善Tra的治疗指数.

目的 建立重组抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein convertase subtilisin/Kexin 9,PCSK9)单克隆抗体关键质量属性的质控方法.方法 根据《中国药典》三部(2020版)及人用药品注册技术要求国际协调会(International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use,ICH)相关要求,采用还原胰蛋白酶肱指纹图谱法对PCSK9单克隆抗体进行一致性鉴别;ELISA法检测抗体特异性;成像毛细管等电聚焦电泳(imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis,icIEF)测定电荷变异体;还原/非还原十二烷基磺酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)检测变异体纯度;分子排阻高效液相色谱(size-exclusion chromatography high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测单体、高分子量和低分子量物质含量;切糖后对N-糖进行2AB标记,采用带有荧光检测器的Waters ACQUITY UPLC系统进行糖型分析;通过HepG2细胞系和含荧光标记的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)测定生物学活性;采用液相检测系统(CAD检测器)检测聚山梨酯20含量.结果 PCSK9单克隆抗体样品存在特征肽段,肽指纹图谱与参比品图谱一致,且含有特异性抗体;样品主峰区、酸性峰区、碱性峰区的相对百分含量分别为(49.27±0.38)％、(46.44±0.35)％、(4.28±0.04)％;"重链+轻链"峰、非糖基重链峰和低分子量物质峰相对百分含量分别为(94.16±0.82)％、(4.11±0.76)％、(0.85±0.20)％,主峰、非糖基化主峰和低分子量物质峰相对百分含量分别为(94.27±0.22)％、(2.85±0.08)％、(2.88±0.15)％;单体、高分子量物质和低分子量物质相对百分含量分别为(98.30±0.03)％、(0.75+0.01)％、(0.96±0.02)％;G0F、G1F、G2F、非岩藻糖基化糖型(G0+G1+G2+Man5)相对百分含量分别为(39.31±0.54)％、(34.69+0.41)％、(9.09±0.14)％、(12.61±0.50)％;相对生物学活性为参比品的(101.64±3.61)％;聚山梨酯20含量为(0.012±0.000 3)％.结论 本研究建立了 PCSK9单克隆抗体关键质量属性的质控方法,可确保该产品的安全、有效和质量可控.

目的 优化重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法,并对优化的方法进行验证.方法 利用SEC-HPLC法对rhGH-Fc免疫融合蛋白中多聚体含量进行检测,优化检测条件(盐浓度、流动相pH、流速、柱温及色谱柱型号),观察目的蛋白与聚合体分离的效果.对方法的系统适应性、专属性、线性与范围、精密性、准确性及定量限进行验证.结果 优化后的方法为采用TSK-gelG2000SWxl色谱柱(5 μm,7.8mm× 300 mm)进行测定,流动相50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.80),检测波长280 nm,进样量100μL,流速0.6 mL/min,柱温45℃.rhGH-Fc免疫融合蛋白与聚合物分离度、理论塔板数、拖尾因子均能满足要求;rhGH-Fc免疫融合蛋白样品与对照品出峰时间一致,GH国家标准品与对照品出峰时间不同,蛋白缓冲液不出峰;rhGH-Fc免疫融合蛋白浓度在0.307～1.842 mg/mL范围内,其峰面积与上样量呈良好的线性关系(R2=0.9994);重复性验证峰面积和纯度的RSD分别为0.7％和0.1％;中间精密性验证的RSD为0.8％;准确性验证的平均回收率为99.1％,RSD为1.9％;定量限为6μg/mL.结论 采用优化后的SEC-HPLC法检测rhGH-Fc免疫融合蛋白多聚体含量,准确性有所提高,柱效与分离度符合《中国药典》四部(2020版)的相关规定,可用于对样品中高分子含量的检测.

目的 建立针对抗程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)/细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)双特异性抗体的关键质量属性质控方法.方法 采用报告基因法测定PD-1靶点的细胞生物学活性,流式细胞荧光分选法测定CTLA-4靶点的竞争结合活性;还原/非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法进行抗体分子大小变异体的控制;成像毛细管等电聚焦电泳(imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis,iCIEF)法测定电荷异质性;运用肽图对抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体进行鉴别;超高效液相色谱法分析糖型.结果 PD-1靶点的细胞生物学活性半数最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)为(6.91±0.78)nmol/L,相对参比品的生物学效价为(103.50±13.08)％,RSD为12.64％;CTLA-4靶点活性的EC50为(0.35±0.28)nmol/L,相对参比品的生物学效价为(99.30±9.15)％,RSD为8.32％;还原CE-SDS的轻链与重链峰面积之和百分比为(98.86±0.02)％.非还原CE-SDS主峰峰面积百分比为(93.07±0.13)％,片段百分比为(4.44±0.13)％,聚体百分比为(2.49±0.15)％.SEC-HPLC单体的峰面积百分比为(97.20±0.01)％,聚体峰面积百分比为(2.68±0.01)％.iCIEF分析的A组峰面积百分比为(38.43±0.54)％,B组峰面积百分比为(43.26±0.32)％,C组峰面积百分比为(11.31±0.14)％,D组峰面积百分比为(7.00±0.17)％.肽图检测抗PD-1/CTLA-4抗体具有相应的特征图谱,能够用于鉴别.占比最高的糖型为GOF,含量为(41.06±0.11)％;含唾液酸的糖型共3种,分别为G2F+G1F-NANA、G2F-NANA和G2F-2NANA,含量分别为(12.44±0.12)％、(12.00±0.05)％和(5.37±0.05)％,含唾液酸糖型的总体含量为(29.80±0.20)％.结论 针对抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的关键质量属性建立了相应的质量控制方法,可确保其安全、有效和质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供了参考.

目的 对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(human recombinant neutrophil inhibitory factor and hiru-log hybrid,TNHH)的处方及工艺进行筛选和优化,并考察其稳定性.方法 以单因素试验结果为依据,pH范围、甘露醇用量、聚维酮K30用量为自变量,高分子蛋白含量为响应值,采用CCF响应曲面设计试验,分析各自变量及其交互作用对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白中高分子蛋白含量的影响,筛选出最优处方.为了方便操作,对最优处方调整后制备中试规模3批样品,分别置于40 ℃、相对湿度(relative humidity,RH)75％条件下2、4周,2～8 ℃条件下 3、6个月,取样,检测外观、pH、反相高效液相色谱(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)纯度和体积排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)纯度,验证该处方和工艺的稳定性.结果 筛选出的最优处方为:pH 4.9826,甘露醇用量7.9864％,聚维酮K30用量1.9027％,最终调整为pH 5.0,甘露醇用量8.0％,聚维酮K30用量2.0％.采用优化处方和工艺制备的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂质量稳定,符合临床用药要求.结论 优选的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂处方工艺合理,适合工业化生产.

目的 研究一株抗生链霉菌次级代谢产物中的抗真菌活性物质.方法 对抗生链霉菌200-09的发酵菌丝体采用95％乙醇提取,经过硅胶柱层析、Sephadex LH-20分子排阻层析、ODS开放柱层析和制备型反相高效液相色谱等手段,对具有抗真菌活性的乙酸乙酯部位进行了化学成分的分离纯化和结构鉴定,并采用纸片法和MTT法分别对化合物进行抗白念珠菌和细胞毒活性检测.结果 从中分离得到了17个单体化合物.通过NMR、MS等方法,并结合与文献数据比对,鉴定分离得到的化合物分别为抗霉素A1a(1)和A1b(2)、A2b(3)、A3a(4)和A3b(5)、A7b(6)、A10a(7)和A10d8)、A15(9)、A16(10)、kitamycin A(11)、urauchimycin B(12)、deisovaleryblastomycin(13)、stmptomyceamide C(14)、麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇(15)、麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(16)、过氧化麦角甾醇(17).结论 化合物3、6-13及15～17均为首次从抗生链霉菌种中分离得到,化合物1～13均有抗白念珠菌和细胞毒活性,其中化合物1～10的抗白念珠菌活性显著.

目的 建立重组人源化抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体关键质量指标的质控方法.方法 经胰蛋白酶切后采用反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)肽图法对3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体进行鉴别,同时采用还原、非还原型十二烷基磺酸钠毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)法、分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法、毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,cIEF)法、阳离子交换高效液相色谱(cation exchange high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法及混合淋巴细胞反应与竞争ELISA相结合的方法分别检测3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体的纯度、单体和聚体含量、等电点、不同电荷异构体的含量及生物学活性.结果 3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体(批号为batch1、batch2、batch3)的肽图图谱与参考品一致;还原型CE-SDS的纯度分别为97.8％、98.1％和97.9％,非还原型CE-SDS纯度分别为95.7％、95.4％和95.5％;单体含量分别为99.3％、99.1％和99.4％,聚体含量为0.5％、0.6％和0.4％;主峰等电点均为7.4;酸性区含量分别为21.8％、21.4％和21.6％,主峰含量分别为58.4％、58.6％和58.7％,碱性区含量分别为19.8％、20.O％和19.7％;相对生物学活性分别为112％、98％和102％.结论 本实验建立的重组人源化抗PD-1单克隆抗体关键质量指标的质控方法可用于该制品的常规质量控制.