目的:建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)的重组酶等温扩增(recombinase-aid amplification，RAA)快速检测方法。方法:通过全球共享数据库下载VZV全基因组序列进行比对分析，针对四个保守基因分别设计特异性引物与探针并筛选出最佳组合，通过引物与探针浓度梯度筛选出最佳反应体系，建立荧光型RAA检测方法。用VZV阳性质粒标准品与梯度稀释的临床样本评价方法的灵敏度，以最低检出极限浓度的阳性质粒标准品进行重复实验评价方法的重复性，以其他病毒核酸评价方法的特异性，同时用本方法和荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qPCR)对临床样本进行检测并对检测结果进行比较。结果:本方法筛选出针对开放阅读框架(open reading frame，ORF)28基因的引物对F2/R2与探针P2为最佳组合；考虑到成本因素，最佳引物浓度为500 nmol/L，最佳探针浓度为280 nmol/L；最低检出极限为10 1拷贝/μL，最低可检测到Ct值为36.027的临床阳性样本；重复实验的检测结果一致；该方法与其他病毒核酸无交叉反应；临床阳性样本的检出率为93.33%，与qPCR检测结果几乎完全一致。 结论:本方法操作简便、灵敏度高、特异性强、对实验条件要求低、检测结果直观可视，在20 min内就能够检测出样本中的VZV核酸，是一种可以被临床检测考虑的VZV快速检测方法。

目的:分析共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)rs1801516、rs1800054两位点单核苷酸多态性(SNP)与蒙古地区散发性乳腺癌(SBC)的相关性。方法:前瞻性收集2018年1月至2019年9月在内蒙古医科大学附属医院就诊的SBC患者102例(汉族72例、蒙古族30例)作为病例组，并选取同期健康体检女性102例(汉族72例、蒙古族30例)作为对照组，采集受试者静脉血2 ml提取细胞核脱氧核糖核酸(DNA)，根据单核苷酸多态性数据库(dbSNP)数据库选取出ATM基因高度多态性rs1801516和rs1800054位点，采用聚合酶链式反应(PCR)及直接测序法检测两位点多态性，分析两位点单核苷酸多态性与内蒙古地区SBC易感的相关性，并分析内蒙古地区SBC患者临床病理因素与ATM基因多态性的关系。结果:ATM基因rs1801516位点检出野生纯合子GG、突变杂合子GA及突变纯合子AA型，rs1800054位点仅检出野生纯合子CC型。各基因型频率及等位基因频率在蒙古族乳腺癌组与汉族乳腺癌组、蒙古族对照组与汉族对照组、蒙古族乳腺癌组与蒙古族对照组、汉族乳腺癌组与汉族对照组中分布差异均无统计学意义(均 P>0.05)。Logistic回归分析显示，等位基因G是内蒙古地区SBC的易感基因( OR：1.775，95% CI：1.04~3.03， P＝0.04)。ATM rs1801516多态性与乳腺癌肿瘤长径≤2 cm和(或)不伴有淋巴结转移的患者乳腺癌患病风险增加有关(均 P<0.05)。 结论:ATM基因rs1801516和rs1800054位点基因多态性可能与内蒙古地区SBC患病风险无明显相关性。rs1801516位点可能与乳腺癌肿瘤长径≤2 cm和(或)不伴有淋巴结转移的患者乳腺癌患病风险增加存在相关性，基因G可能是内蒙古地区SBC的易感基因之一。

目的:建立能够准确鉴别诃子、绒毛诃子及其混伪品的分子鉴定方法.方法:对诃子、绒毛诃子及其混伪品的新鲜果实进行烘干,观察其干燥前后的形态;提取样品DNA,采用DNA条形码内转录间隔区 2(ITS2)序列和psbA-trnH序列进行聚合酶链式反应扩增并测序,采用DANMAN 7、MAGE 6 软件对测序结果进行序列比对,计算Kimura 2-paramete遗传距离,并构建邻接法系统发育树.结果:形态观察发现,诃子、绒毛诃子果实干燥前后与混伪品有较大的差异,可以通过形态差异进行鉴别;DNA条形码序列表明,诃子和绒毛诃子ITS2 序列基本一致,仅发现 4 个单核苷酸多态性位点,但不能由此对两者进行区分;诃子和绒毛诃子的psbA-trnH序列存在 2 处明显差异,可对两者进行准确区分;绒毛诃子中存在 2 种类型的单倍型,其明显差异在于是否在psbA-trnH序列上存在 1 段 16 bp的串联重复序列;混伪品与诃子、绒毛诃子之间具有较大的psbA-trnH序列差异,可直接在美国国家生物技术信息中心比对进行区分;对市场上流通的诃子炮制品进行鉴定发现,其多为 2 种单倍型绒毛诃子,且存在毛诃子混伪的情况.结论:利用psbA-trnH序列可准确鉴别诃子、绒毛诃子及其混伪品,发现绒毛诃子中存在 2种类型的单倍型.

目的 检测湖北省地区26例中国人高苯丙氨酸血症家系基因突变,研究其基因型、表型和遗传学特征.方法 采集2018年3月至2020年12月在武汉儿童医院就诊的26例HPA患儿和父母静脉血样本,并收集其临床资料,提取DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增PAH基因和PTS基因编码区及其侧翼序列,并以直接测序法对扩增产物正反测序进行突变分析.同时选取同时段来本院健康体检无明显异常儿童100名为正常对照组,处理方式与患儿相同.结果 患儿中检出PAH基因突变24种,其中c.728G>A(R243Q)最常见,等位基因突变率为15.2％(7/46).发现一新PTS基因突变IVS3+9A>G.3例BH4缺乏型患儿中检出PTS基因P87S、D96N和A111T突变,其中P87S是最常见致病突变.在正常对照组中,未检出以上患儿中携带的突变,仅检出三种突变Q232Q(c.696A>G)、V245V(c.735G>A)和L385L(c.1155G>C),均为同义突变,不改变编码氨基酸,属于正常DNA多态.结论 PAH基因突变引起患儿PAH缺乏型HPA,而PTS基因突变引起严重型BH4缺乏症.基因检查的结果可为临床诊断和选择合适的治疗方案提供参考,并且可为进一步生育指导提供参考.

目的:探究髓系/淋巴系或混合谱系白血病3基因(myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3,MLL3)对宫颈癌细胞生长、转移、放射敏感性的影响.方法:选择60例宫颈鳞癌患者的癌组织及配对癌旁组织,采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测检测MLL3 mRNA水平.体外培养SiHa细胞,将其分为以下5组:Control组(不转染)、NC-sh组(转染阴性对照shRNA慢病毒)、MLL3-sh组(转染MLL3 shRNA慢病毒)、NC-OE组(转染阴性对照过表达慢病毒)和MLL3-OE组(转染MLL3过表达慢病毒).进一步采用2300EX直线加速器9 MeV β射线照射细胞建立放射抵抗SiHa细胞(SiHaR),然后将其分为:NC-sh组、MLL3-sh 组、8 Gy+NC-sh 组和 8 Gy+MLL3-sh 组.NC-sh 组和 MLL3-sh 组细胞不照射,8 Gy+NC-sh 组和 8 Gy+MLL3-sh 组细胞用9 MeV β射线照射8 Gy.采用MTT法检测细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;Transwell检测细胞侵袭能力;qRT-PCR检测MLL3、共济失调毛细血管扩张征突变基因(ATM)、ATM-Rad3相关基因(ATR)、乳腺癌易感基因(BR-CA1)和RAD50双链断裂修复蛋白(RAD50)的mRNA水平;Western blot检测MLL3、Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、cleaved caspase 3、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9和γ-H2AX的表达;免疫荧光染色检测γ-H2AX的表达.结果:与癌旁组织相比,宫颈鳞癌组织中的MLL3 mRNA水平显著降低(P＜0.001).与NC-sh组比较,MLL3-sh组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量降低,Bcl-2蛋白相对表达量升高,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量升高(P＜0.05).与NC-OE组比较,MLL3-OE组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量降低(P＜0.05).与SiHa细胞相比,SiHaR细胞中的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量均升高(P＜0.001).与8 Gy+NC-sh组比较,8 Gy+MLL3-sh组SiHaR细胞的细胞活力降低,γ-H2AX的蛋白相对表达量和γ-H2AX foci数目升高,ATM、ATR、BRCA1和RAD50的mRNA水平降低(P＜0.05).结论:宫颈癌细胞MLL3的表达下调促进了其生长和转移,但降低DNA损伤修复能力,提高宫颈癌细胞的放射敏感性.

目的 建立一种基于离心式微流控技术的检测流感病毒分型的直扩PCR法.方法 设计特异性引物探针,采用离心式微流控芯片对流感病毒不同分型进行直扩荧光PCR检测,进一步评价该方法灵敏度、特异性、重复性和线性关系;用该直扩荧光PCR法检测576例临床标本,并用核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行验证.结果 离心式微流控直扩PCR法的总体最低检出限为500 copies/mL;与常见呼吸道病原体无交叉反应;精密度均小于4.34％;具有良好的线性关系(R2均>0.98);576例临床标本中检出甲型流感病毒通用型75例,其中H1N126例,H3亚型49例;乙型流感病毒通用型74例,均为Victoria系.与对照试剂比较,离心式微流控PCR法在流感病毒不同分型的灵敏度、特异性、总符合率均高于92.9％,两种方法检出阳性率(IAV、H1N1、H1、H3、IBV和IBV-V)差异均无统计学意义(χ2值分别为3.200、0.500、0.500、1.333、2.250、2.250,P均>0.05),具有极好的一致性(Kappa值均>0.96).结论 建立的离心式微流控直扩PCR法操作简便,灵敏度和特异性较高,可为流感病毒的临床诊断和流行病学调查提供有效的检测工具.

目的·基于Cre-Loxp系统构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠并验证其敲除效率.方法·将Cx3cr1creERT2与Stat3fl/fl基因型小鼠多代交配繁育,直到获得足够数量的Stat3fl/fl;Cx3cr1creERT2基因型小鼠,即条件敲除小鼠(conditional knockout,CKO);同窝Stat3 fl/fl基因型小鼠,即对照小鼠(wild type,WT).利用小鼠组织提取DNA后通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),结合特异性引物分别扩增的结果来判断小鼠基因型.在CKO及WT 小鼠6周龄时通过腹腔注射他莫昔芬诱导小胶质细胞中Stat3基因的敲除;2周后,随机选取CKO小鼠(n=4)及WT 小鼠(n=4),利用磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分选出小胶质细胞后通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)技术从基因水平检测基因敲除效率;通过脑组织切片免疫荧光染色标记小胶质细胞和STAT3蛋白观察小胶质细胞中STAT3的表达情况;利用流式细胞术分别检测STAT3在小胶质细胞及脾巨噬细胞中的变化.通过尼氏染色检测神经元细胞的情况;通过脑组织切片荧光染色标记小胶质细胞,观察皮层和海马区域小胶质细胞的情况;通过流式细胞术检测小胶质细胞表型.结果·成功繁育出CKO小鼠和WT小鼠.MACS后脑细胞中小胶质细胞的占比从10%提升到85%.RT-PCR结果显示,相对于WT小鼠,CKO小鼠小胶质细胞中Stat3的mRNA相对表达量为0.331 7±0.041 4,mRNA水平下调(P=0.001).脑组织免疫荧光染色结果显示,CKO小鼠小胶质细胞中STAT3蛋白的荧光强度较WT小鼠弱.脑组织流式细胞术显示:WT小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(85.30±5.69)%;CKO小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(39.70±3.88)%,STAT3表达率下降(P=0.001).脾组织流式细胞术显示,CKO小鼠与WT小鼠脾巨噬细胞中STAT3的阳性细胞占比的差异无统计学意义(P>0.05).尼氏染色显示,CKO小鼠与WT小鼠神经元细胞无显著差异.脑组织切片荧光染色结果显示,CKO小鼠与WT小鼠的小胶质细胞在形态上无明显差异.小胶质细胞流式细胞术显示CKO小鼠与WT小鼠小胶质细胞表型无显著差别.结论·成功构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠,为后续相关研究提供动物模型.

目的 探究结直肠癌术后切口感染患者分离产β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的耐药性及分子分型.方法 收集 2018 年 5 月-2021 年 5 月于中国医科大学附属盛京医院进行手术治疗的结直肠癌患者术后切口感染分泌物分离出的大肠埃希菌 105 株,筛选产 ESBLs大肠埃希菌菌株 48 株,采用纸片扩散(K-B)法进行药敏试验,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增鉴定产 ESBLs大肠埃希菌β-内酰胺酶基因型,采用多位点序列分型(MLST)分析产ESBLs大肠埃希菌ST分型.结果 48 株产ESBLs大肠埃希菌对碳青霉烯类抗菌药物完全敏感,对阿米卡星、妥布霉素耐药率分别为 18.75%和 25.00%,但对其他抗菌药物耐药率均较高,表现为多重耐药;产 ESBLs大肠埃希菌对常用抗菌药物(阿米卡星、妥布霉素、亚胺培南和美罗培南除外)的耐药率高于非产 ESBLs 大肠埃希菌(P<0.05);48 株产 ESBLs大肠埃希菌均检出β-内酰胺酶基因,其中 31 株(64.58%)检出携带TEM-1 基因,19 株(39.58%)检出携带CTX-M-14 基因;48 株产 ESBLs大肠埃希菌共有 10 种 ST分型,以 ST131(31.25%)为主.结论 结直肠癌术后切口感染患者分离产 ESBLs大肠埃希菌表现为多重耐药,对多种抗菌药物存在不同程度耐药,产 ESBLs大肠埃希菌以TEM-1、CTX-M-14 为主要基因型,主要 ST分型为 ST131 型.

目的 筛查广东省氡辐射地区汉族人群中8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(hOGG1)基因5′侧翼区遗传多态性位点,并分析其遗传分布特征.方法 采用单纯随机抽样方法,选择60名广东氡辐射地区汉族人群作为研究对象,采集肘静脉血抽提其基因组DNA,采用聚合酶链式反应法扩增获得hOGG1基因5′侧翼区(-1721 nt～+164 nt)目的片段产物后纯化直接测序,筛查并确证潜在的单核苷酸多态性(SNP)位点,对SNP位点进行遗传特征分析,并与人类基因组单体型图(HapMap)数据库中报道的不同人群分布数据进行比较.结果 PCR扩增和成功测序60名(120条染色体)氡辐射地区汉族人群hOGG1基因5′侧翼区目的片段.序列比对发现该人群中8个SNP位点;其中,3个已知位点-1493 G>A、-834 G>C和-18 G>T的最小等位基因频率分别为4.2％、0.8％和3.3％;5个新位点-1455 G>A、-1293 A>T、-1187 C>A、-337 C>A和-323 G>A的最小等位基因频率分别为0.8％、23.3％、7.5％、36.7％和0.8％.-1493 G>A的等位基因频率在氡辐射地区汉族人群的分布与HapMap数据库中欧洲高加索人种/人群的分布比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 筛查出广东氡辐射地区汉族人群中hOGG1基因5′侧翼区共8个SNP位点,并获得其等位基因遗传分布特征,为后续目标人群多态性单体型构建及其功能分析提供基础.

目的:筛选硅藻叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase,rbcL)基因的特异性引物,建立溺死尸体组织内硅藻rbcL基因的聚合酶链式反应-毛细管电泳(polymerase chain reactioncapillary electrophoresis,PCR-CE)检测方法,探讨在溺死诊断中的应用价值.方法:采用荧光标记引物扩增硅藻rbcL基因,对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA扩增产物进行PCR-CE检测,验证引物特异性和灵敏度.检测溺死尸体组织样本中硅藻,并比对微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法(microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy,MD-VF-Auto SEM)检测结果.结果:使用引物ND-rbcL对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA进行扩增,其中舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻和骨条藻6种硅藻的CE检测结果为阳性,DNA片段为197 bp,其他为阴性.6种硅藻DNA检测阳性的灵敏度分别为0.502、0.117、0.029、0.042、0.275和0.215 ng(20 μL扩增体系).PCR-CE方法检测35例尸体(3例陆地正常死亡尸体,2例水中发现非溺死尸体,30例溺死尸体)的组织样本,肺脏、肝脏和肾脏硅藻检出率分别为100％、63.3％和53.3％,检测总阳性率为83.3％.当溺水死亡尸体脏器组织内硅藻含量＞10个/10 g时,使用MD-VF-Auto SEM方法检测,其检测总阳性率为100％,PCR-CE方法检测,其检测总阳性率为92.6％,两者对检测溺死尸体脏器中硅藻阳性率无统计学差异(x2=2.077,P=0.491);当硅藻含量＜10个/10 g时,PCR-CE方法检测为阴性,与MD-VF-Auto SEM方法检测溺死尸体各种脏器中硅藻阳性率具有统计学差异(P＜0.05).结论:基于ND-rbcL引物建立的PCR-CE法能快速检测硅藻rbcL基因,所需检材量小,易于推广,在溺死诊断中有较好地应用前景.