目的:构建并制备表达人CD137L蛋白的5型重组腺病毒（Ad5-CD137L），并初步研究其在小鼠中的抗肿瘤免疫效果。方法:将密码子优化CD137L蛋白的表达基因插入pDC316穿梭质粒,并与pBH-GloxΔE1,3Cre腺病毒骨架质粒，共同转染HEK293细胞，构建Ad5-CD137L种子。扩增并纯化后，对所得Ad5-CD137L重组腺病毒的插入目的基因与蛋白表达情况进行鉴定。检测Ad5-CD137L在C57BL/6小鼠体内的特异性细胞免疫和抗肿瘤免疫水平。结果:成功地构建了Ad5-CD137L，PCR和测序结果表明插入目的基因与构建理论值相符。免疫荧光法鉴定Ad5-CD137L能在HEK293细胞中表达目的蛋白，经Western印迹法鉴定该目的蛋白的相对分子质量约为25 000，与理论值相符。与空腺病毒相比，Ad5-CD137L能显著诱导小鼠特异性IFN-γ（ t=6.315， P=0.003），抗肿瘤免疫效果更显著（ t21 d=8.275， t29 d=4.492； t39 d=5.101， P均<0.001）。 结论:成功构建了Ad5-CD137L，该重组病毒具有特异性细胞免疫原性和抗肿瘤免疫效果。

藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)营养丰富且抗逆性较强.本研究以M059(胚根生长快)和M024(胚根生长慢)两种藜麦种质材料为研究对象,采用PEG-6000模拟干旱胁迫,观察种子表型的解剖结构,对发芽种子进行糖含量测定,并对正常水处理和干旱处理的材料进行转录组测序.种子表型及糖含量测定结果显示:与正常水处理相比,15％PEG-6000处理24h后M059和M024胚根长度分别降低68.65％和71.43％;在正常水处理条件下,M059的可溶性总糖、蔗糖、葡萄糖和果糖含量较M024 高 18.58％、97.84％、70.54％和 32.77％;在 15％PEG-6000 处理 24 h后,M024 的蔗糖含量比M059 高 23.01％,M059 的可溶性总糖和葡萄糖含量比M024分别高7.26％和25.00％.韦恩图分析结果表明,C1vsD1、C2vsD2、C1vsC2和D1vsD2比较组中共有差异表达基因211个,特异性差异表达基因分别为132个、1270个、578个和914个.GO富集分析表明,与干旱胁迫下藜麦种子糖代谢的分子响应密切相关的GO通路有5条.KEGG富集分析表明,与干旱胁迫下藜麦种子糖代谢密切相关的代谢途径有3条.根据差异表达基因的功能注释,有 10 个差异表达基因(LOC110702784_AGAL2、LOC110719866_INV1、LOC110717843_TPPJ、LOC29490_CELB、LOC110719843_bg1x、LOC110689796_SUS1、LOC110690728_MAN6、LOC110729879_HK2、LOC110712726_EGLC、LOC110734349FK7)与糖代谢相关,且这10个差异表达基因的qRT-PCR验证结果与转录组结果一致.本研究结果将对深入解析藜麦响应干旱的分子调控机制提供参考.

背景:将种子细胞与3D生物打印技术相结合可特异性地构建各种组织和器官以满足组织修复的需求,但对于损伤组织促血管化的有关研究仍有待深入.目的:通过培养负载成纤维细胞的甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架获得上清液并与完全培养基按不同比例混合,以模拟组织修复过程中的细胞微环境,探究多种细胞微环境对内皮细胞促血管化的作用.方法:采用挤压式3D生物打印工艺制备负载成纤维细胞的甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架,制备水凝胶支架浸提液;将水凝胶支架浸提液与完全培养基按照1∶1、1∶2、1∶4的体积比混合获得条件培养基.将小鼠胚胎成纤维细胞BALB3T3、人脐静脉内皮细胞分别与完全培养基(对照组)、水凝胶支架浸提液共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖,活/死细胞染色分析细胞活性.采用3种条件培养基与完全培养基(对照组)分别与人脐静脉内皮细胞共培养,进行成管实验、血管基因检测与CD31免疫荧光染色.结果与结论:①扫描电镜下可见水凝胶支架呈多孔性结构,流变学结果显示该水凝胶具有良好的机械性能,CCK-8检测与活/死细胞染色显示该水凝胶支架浸提液无明显的细胞毒性.②成管实验显示,1∶1条件培养基组细胞成管总长度小于对照组(P＜0.05),4组细胞成管分支数比较差异无显著性意义(P＞0.05).③qRT-PCR检测显示,对于血管内皮生长因子mRNA表达,培养第1天,1∶2条件培养基组低于1∶1条件培养基组(P＜0.01);培养第3天,1∶2条件培养基组高于对照组(P＜0.01);培养第5天,1∶2条件培养基组高于其他3组(P＜0.01或P＜0.000 1),1∶1条件培养基组低于其他3组(P＜0.05或P＜0.01).对于碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达,培养第1天,1∶1条件培养基组高于对照组、1∶4条件培养基组(P＜0.01,P＜0.05),1∶2条件培养基组高于对照组(P＜0.05);培养第3天,1∶4条件培养基组高于对照组(P＜0.05).④培养第3天,1∶2条件培养基组CD31表达高于对照组、1∶4条件培养基组(P＜0.05).⑤结果表明该条件培养基可模拟组织损伤后血管再生微环境,进而促进内皮细胞的血管化进程,并且1∶2条件培养基促血管化效果最好.

植物为宿主表达外源蛋白的系统称之为分子农场,通过农杆菌将外源基因导入植物进行表达具有高效、安全、廉价的优点,特别是植物具备一系列翻译后修饰功能,因此该系统能弥补原核表达系统的缺陷.本综述首先介绍了近些年在烟草叶片瞬时表达和水稻胚乳组织特异性表达上取得的进展,特别是一些利用分子农场进行医用蛋白表达、药物合成、疫苗制备等典型案例.在优化生物反应器、提高表达效率策略上,本综述重点探讨了蛋白翻译后水平上的调控,包括蛋白酶抑制剂的作用、糖基化修饰环节以及分子伴侣共表达等对外源蛋白表达的影响.最后,围绕外源蛋白大量囤积于内质网可能引发内质网胁迫的问题,展望了通过优化内质网环境来提高外源蛋白表达效率的可行性.

真菌内生细菌是一类特殊细菌,在寄主真菌体内及生态系统中发挥重要作用.为发掘盘龙参内生真菌内具有促生功能的内生细菌资源,并探索其生物学功能,采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测高粱附球菌Epicoccum sorghinum菌丝中内生细菌的存在后,利用菌丝组织研磨法分离内生细菌,通过菌落形态、生理生化特性及分子特征对其进行鉴定.运用特异性引物验证细菌的内生性,采用Salkowski比色法、CAS比色法以及钼锑抗比色法对菌株的促生特性进行测定,通过水稻种子促生长实验初步验证内生细菌的促生长能力,并对内生细菌进行全基因组测序和促生相关功能基因分析.真菌E.sorghinum菌丝内能观察到与荧光素标记的单链核酸探针杂交后的细菌,证实其菌丝内含有细菌,从菌丝内分离出一株内生栖稻根瘤菌Rhizobium oryzihabitans 7-2H,具有产吲哚乙酸(IAA)、铁载体和溶磷能力,可显著提高水稻幼苗的茎长、根长、鲜重和干重.菌株 7-2H与标准菌株R.oryzihabitans M15 基因组之间的平均核酸一致性(average nucleotide identity,ANI)值为 96.98%,通过对基因组分析发现,菌株 7-2H含有与产IAA、铁载体及溶磷能力相关的基因.分离得到一株真菌内生栖稻根瘤菌,该菌具有良好的促进植物生长特性,可作为后续研发微生物菌肥的菌种资源.

花器是种子生成的基础,水稻花器发育直接影响稻谷产量与品质.源美丝苗与P704杂交后代中发现一株开颖突变体(ohi,open-hull),其穗部发育有缺陷,主要表现为:开颖,结实率显著下降,种子变小.遗传分析发现开颖表型由一对隐性细胞核基因控制.通过BSA分析,开颖基因被定位于水稻第3染色体上,检索发现候选区间与OsMADS1(LOC_Os03811614)基因重合,与蜀恢498参考基因序列进行比对,oh中OsMADS1的第一外显子第118位发生碱基颠换,导致编码的天冬氨酸变成酪氨酸,将该等位基因命名为OsMADS1oh.从oh中克隆OsM4DS1oh并构建过表达载体,通过农杆菌介导转入易转化材料(中花11)中,转基因后代出现开颖表型,证实OsMADS1oh导致开颖.另外,RNA定量分析结果表明,MADS8和YABB5的表达受OsM4DS1调控.本研究从育种材料中筛选到开颖突变体,并从中鉴定了新的OsMADS1等位基因,为阐明花器形成的分子机理研究提供了特异种质和基因资源.

目的:选育优良广金钱草品种(系).方法:采用迭氮钠(NaN3),甲基磺酸乙酯(EMS)和秋水仙素最佳剂量对广金钱草种子进行诱变处理,初步筛选出13株表型变异的广金钱草植株,对广金钱草变异植株及对照基因组DNA进行相关序列扩增多态性(SRAP)分析.结果:广金钱草在株高、地茎、分枝状况等方面发生大量变异;10对SRAP引物扩增出多态性条带3 285个,平均每对引物扩增出328.5条带,多态性比例平均为96.45％,广金钱草化学诱变植株遗传相似系数范围0.326～0.476,遗传相似系数较低,表明经化学诱变剂处理后广金钱草在基因组水平上存在真实的遗传差异;相似性差异程度大小顺序为V-13＞V-7＞ V-6＞ V-1 1＞V-10＞ V-12＞ V-9＞ V-8＞ V-4＞ V-5＞ V-3＞V-2＞ V-1,表明NaN3在分子水平上对广金钱草的影响比EMS和秋水仙素小;化学诱变处理后广金钱草变异程度高于不同种源地的变异,进一步表明人工诱变育种可以缩短育种年限,提高突变率.结论:该研究揭示了广金钱草化学诱变株表型特异性和遗传多样性,筛选了一些特异资源,为高产优质广金钱草新品种(系)的选育提供重要的科学依据.

油棕属棕榈科多年生木本油料作物,果实含油量高达50%,且单位面积产油量高,享有"世界油王"美誉.油棕果实由外果皮、中果皮、内果皮(种壳)、种子四个部分组成,产油部分主要是中果皮和种子,其中种壳厚度是影响果实含油量的重要因素.SHELL基因控制种壳厚度,是一类MADS?box同源基因,SHELL基因在厚壳种和无壳种中的变异主要是第一个外显子上的两个SNP位点.该研究根据两个SNP 位点进行特异标记开发,根据已知的油棕SHELL基因的序列,设计了4对SNP引物.4对SNP引物以2个SNP 位点设计,每个SNP位点设计2对SNP标记,并均在引物3′端第二位引入强错配碱基.以2份薄壳种油棕材料和2份厚壳种油棕材料DNA为模板,扩增筛选油棕SHELL基因SNP 引物.通过 PCR扩增发现,设计的SHELL基因特异SNP标记EgSh(N)?f/EgSh(SNP)?2r能够鉴别油棕厚壳种和薄壳种.再用24株油棕树进行特异性验证,发现该标记能较准确地判断油棕的厚薄壳.该研究结果表明 SNP 标记 EgSh(N)?f/EgSh (SNP)?2r可用来进行油棕种质资源早期分子鉴定,为高产油棕品种选育提供了技术支撑.

以凤丹牡丹(Paeonia ostii)叶片为试验材料,采用 RACE和 RT-PCR方法,克隆得到凤丹牡丹硬脂酰-ACP去饱和酶基因 SA D的cDNA全长,命名为 PoSA D(GenBank登录号为KY038819).序列分析表明,该基因cDNA序列全长1559 bp,其中开放阅读框1197 bp,编码398个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,5′端非编码区长123 bp.多序列比对结果表明,凤丹牡丹 PoSA D氨基酸序列含有2个保守结构域.系统发育分析结果显示,凤丹牡丹与蓖麻处于同一分支,其亲缘关系最近.TMHMM 和 TargetP 亚细胞定位分析得知,PoSAD 蛋白无跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥功能.组织特异性结果分析表明,PoSA D基因在凤丹牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,且在花瓣中表达量最高,雌蕊中次之,在根中的表达量最低;不同时期种子中,60 d表达量最高, 80 d次之,10 d中表达量最低.

生长素极性运输输出载体OsPIN1基因家族可能参与调控水稻根负向光性,其中OsPIN1a和OsPIN1b参与水稻根负向光性已得到证实.为了研究OsPIN1d基因与水稻根负向光性形成的关系,依据GenBank数据库中OsPIN1d (Accession number:BR000830)的核苷酸序列,设计特异性引物,通过RT-PCR从水稻根尖的cDNA中扩增出完整的OsPIN1d基因全长.生物信息学分析表明,OsPIN1d的序列全长为1 497 bp,编码554个氨基酸,GC含量为64.08％;氨基酸序列多重比对及系统发育树构建表明,OsPIN1d与水稻OsPIN1b、玉米OsPIN4以及拟南芥AtPIN2、OsPIN1c、OsPIN1a和AtPIN1等基因的遗传距离较近.通过构建融合超表达载体pCAM-BIA-1301-OsPIN1d∷GFP,转化并获得其转基因水稻,经RT-PCR检测和GUS染色结果显示,外源片段已成功整合到水稻基因组内,并在根部高效表达;受单侧光照射后,转基因水稻种子的根负向光性明显大于野生型,且向光侧OsPIN1d-GFP荧光密度明显弱于背光侧.研究表明,OsPIN1d参与了水稻根负向光性的IAA和NAA的运输,从而促进了根负向光性的形成.