目的:研究核酸内切酶RNaseH-1对使用端粒的替代延长(ALT)机制来延长端粒的骨肉瘤细胞放射敏感性影响及机制。方法:通过慢病毒转染构建过表达RNaseH-1的ALT骨肉瘤细胞U2OS和端粒酶阳性骨肉瘤细胞143B。对转染后的细胞使用CCK8法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期。克隆形成实验检测放射敏感性，免疫荧光实验检测细胞DNA损伤(γ-H 2AX灶点)情况，蛋白印迹法实验检测相关蛋白表达水平。 结果:过表达RNaseH-1后U2OS细胞的增殖能力显著降低，且细胞周期阻滞于G 1期(均 P<0.05)。U2OS细胞中RNaseH-1的过表达使ATM和Chk2的磷酸化水平显著升高、同源重组相关蛋白RAD51和BRCA1的表达显著降低，并导致细胞中DNA损伤水平显著上升、细胞放射敏感性增强(均 P<0.05)。而过表达RNaseH-1不对端粒酶阳性的143B细胞产生抑制效应( P>0.05)。 结论:过表达RNaseH-1抑制了端粒酶阴性骨肉瘤细胞并增强了放射敏感性，其机制可能是RNaseH-1在ALT细胞中抑制同源重组修复并激活ATM信号通路。

背景:透钙磷石作为可吸收的磷酸钙骨水泥和骨替代植入材料,在性质特征上存在一些不足,学者们尝试对透钙磷石进行改性,以期能增强其机械性能,延长固化时间,提高成骨作用.目的:制备掺镁透钙磷石骨水泥,通过理化性能、生物活性和修复骨缺损能力检测掺镁透钙磷石骨水泥作为骨替代材料的可行性.方法:采用烧结法将镁离子引入 β-磷酸三钙,设置Mg/(Mg+Ca)摩尔百分比分别为0%、6.67%、26.67%,制备掺镁透钙磷石骨水泥,采用扫描电子显微镜观察骨水泥的形态,万能材料实验机检测骨水泥的抗压强度.将0%、6.67%、26.67%掺镁透钙磷石骨水泥浸提液分别加入兔抗凝血中,检测溶血率.制备24只家兔双侧桡骨骨缺损模型,分4组干预,其中3组骨缺损处分别植入0%、6.67%、26.67%掺镁透钙磷石骨水泥,空白组不做任何处理,植入后4,8周进行X射线检查.结果与结论:①扫描电镜显示,0%掺镁透钙磷石骨水泥为堆积紧密的板片状和少量颗粒状,孔隙较少;6.67%掺镁透钙磷石骨水泥呈不规则团块状和短棒状;26.67%掺镁透钙磷石骨水泥为团块状、圆球状和颗粒状等结构;②0%、6.67%、26.67%掺镁透钙磷石骨水泥的抗压强度分别为31.99,26.38,24.44 MPa;③所有透钙磷石骨水泥的溶血率均小于5%;④X射线显示,植入4周时,空白组缺损区边缘规则,无新骨形成;掺镁0%组骨水泥周围溶解,与骨缺损交界处有少量高密度影像;掺镁6.67%组骨水泥大部分溶解,大量新骨形成;26.67%掺镁组骨水泥周围溶解,中央呈高密度团块,新生骨量较少.植入8周时,空白组两断端处有新骨沉积影像;未掺镁组新生骨呈楔形堆积;掺镁6.67%组骨缺损处基本充满新骨,骨皮质连续;掺镁26.67%组新骨呈桥接式链接骨缺损断端,塑性差;⑤结果表明掺镁6.67%透钙磷石骨水泥具有良好的机械性能与成骨效果.

端粒长度和结构的稳定与肿瘤及衰老的发生密切相关, 端粒维持机制 (telomere maintenance mechanism, TMM) 的激活对稳定基因组和建立细胞永生化至关重要.85％～90％的肿瘤细胞是通过激活端粒酶来维持端粒长度的, 10％～15％的肿瘤细胞在端粒酶失活或不足的情况下, 利用同源重组或其他多种机制维持端粒长度, 这些端粒维持机制统称为端粒延长替代机制 (alterative lengthening of telomere, ALT).ALT端粒DNA通过染色体外游离的端粒重复DNA来合成.这提示, 在ALT端粒维持时进行的DNA修复机制可能有利于阐明衰老与肿瘤之间的辩证关系.该文从ALT端粒DNA维持的角度, 阐述和总结了ALT肿瘤中几种DNA修复途径及ALT活性相关蛋白如何维持端粒长度和功能的完整性.

α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁(ATRX)基因是位于X染色体的α地中海贫血伴智力低下综合征的致病基因,在染色质重塑、基因组和端粒稳定性的维持中起重要作用.约30％的胶质瘤患者存在A RX基因突变及其编码的ATRX蛋白缺失,是世界卫生组织(WHO)Ⅱ、Ⅲ级星形细胞瘤以及继发性胶质母细胞瘤的特征性分子改变.此外,ATRX基因突变可作为评估胶质瘤患者预后的指标.ATRX缺失的胶质瘤细胞通过端粒替代延长机制维持端粒的长度,其端粒DNA的损伤重,克服端粒DNA的损伤可能是此类胶质瘤快速恶性进展的重要机制,针对端粒DNA的损伤修复进行干预可能达到靶向治疗的效果.

大量研究发现,染色体重塑相关基因(ATRX/DAXX、ARID1A)、MEN-1基因、DNA损伤修复基因(MUTYH)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路相关基因的异常改变共同参与了无功能性胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasia,pNEN)的发生发展.作为功能性pNEN的代表,胰岛素瘤常出现拷贝数异常,伴随转录因子YY1的热点突变.驱动基因突变、DNA损伤修复、DNA甲基化、 组蛋白修饰、 染色体重塑和端粒替代延长机制激活等表观遗传学的异常改变以及相关信号通路的异常激活协同引起pNEN增殖和侵袭.这些分子机制及基因分型具有十分重要的意义,可为临床个体化综合治疗和预后判断提供依据,使更多的pNEN患者从精准医学中获益.

端粒酶是一种具有逆转录活性的核糖核蛋白,由非编码RNA模板(端粒酶RNA成分,telomerase RNA template component,TERC)和蛋白成分共同构成,能在酶亚基(端粒酶逆转录酶,telomerase reverse transcriptase,TERT)作用下,从头合成端粒DNA序列[1].人类胚胎发育早期,很多组织可检测到端粒酶活性,但妊娠12～18周时发生了转录沉默,随着人类组织和细胞分化,端粒酶活性迅速降低.从机制上讲,除少部分通过端粒的替代性延长(altemative lengthening of telomeres,ALT)机制[2],缺乏TERT/端粒酶活性无法维持细胞持续增殖所需的端粒长度,严重缩短的端粒会触发端粒功能障碍并激活DNA损伤反应途径,从而导致细胞生长停滞.

端粒是线性染色体末端的DNA-蛋白质结构,可保护染色体末端免于降解和融合.由于大多数体细胞中存在末端复制问题和端粒酶缺乏的固有限制性,端粒DNA随着细胞每次分裂而缩短.短端粒或功能失调的端粒可诱导持续的DNA损伤反应,从而触发细胞复制性衰老.端粒长度主要通过端粒酶和端粒替代延长途经2种端粒机制维持.此外,端粒DNA还会被转录,生成含有端粒重复序列的RNA(telomericrepeat-containingRNA,TERRA),积极参与端粒维持和染色体末端保护.端粒长度是一种复杂的遗传特征,受遗传、疾病和环境因素的影响.流行病学数据显示,端粒长度与衰老、癌症、端粒生物学疾病及多种衰老相关疾病之间存在不同程度的关联.随着端粒长度检测方法的不断发展,血细胞端粒长度作为人类衰老生物标志物和衰老相关疾病的危险因素得到了广泛研究,具有作为生物标志物的潜力.

目的:探讨GADD45A对骨肉瘤细胞的增殖和端粒调控功能.方法:应用siRNA和shRNA处理骨肉瘤细胞U2OS,观察骨肉瘤细胞增殖、端粒功能和端粒延长替代途径的变化.qPCR检测GADD45A敲低后mRNA水平.CCK-8实验和克隆形成实验检测骨肉瘤细胞增殖情况.细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验检测端粒功能变化.免疫荧光-荧光原位杂交实验和C-circle实验检测端粒损伤情况和端粒延长替代途径相关表型.结果:qPCR结果表明,siRNA敲低GADD45A后 mRNA水平降低(t=25.96,P＜0.000 1);shGADD45A-1 和shGADD45A-2 GADD45A的mRNA水平降低(t=21.12、18.37,均P＜0.000 1).对应的CCK-8(t=5.051、6.192、3.775、14.86、22.93、3.013、14.61、20.93,均P＜0.05)和克隆形成实验(t=46.68、23.73、24.98,均P＜0.000 1)结果表明,敲低GADD45A抑制了骨肉瘤细胞增殖.细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验结果显示,GADD45A缺失会加重端粒多信号(t=24.04、7.243、27.93,均P＜0.01)和端粒信号缺失现象(t=8.222、16.61、6.781,均P＜0.01).免疫荧光-荧光原位杂交实验结果表明,siRNA敲低GADD45A后H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒的共定位增加(t=19.16、10.65,均P＜0.0001);shGADD45A-1、shGADD45A-2 也证实了H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒共定位的比例升高(t=14.71、24.03、16.69、18.10,均P＜0.000 1).C-circle实验结果表明,siRNA敲低GADD45A以及shGADD45A-1 和shGADD45A-2 两细胞系中染色体外端粒DNA环C-circle水平升高(t=41.27、14.06、4.539,均P＜0.05).结论:GADD45A调控端粒延长替代途径、保护端粒功能并促进骨肉瘤细胞增殖.