通过高通量药物库筛选挖掘针对金黄色葡萄球菌（ S. aureus，简称：金葡）的新型抗菌药物。本研究的类型为实验性研究。金葡临床菌株均于2017年1月至2019年1月分离自中南大学湘雅三医院呼吸科住院患者的痰液标本；通过摇菌培养浮游菌，检测美国食品药品监督管理局（FDA）认证药物库（包含1573种小分子）对金葡浮游菌增殖抑制作用；通过96孔板结合结晶紫染色，检测FDA认证药物库分子对金葡生物被膜形成的抑制作用；通过微量肉汤稀释实验，检测纳入小分子的最低抑菌浓度（MIC）；最后，通过CCK-8实验检测小分子药物的细胞毒性。结果显示，通过将FDA认证药物库中的小分子浓度设置为100 μmol/L，初步筛选出218种对金葡浮游菌具有生长抑制作用的小分子。这些小分子以抗感染药物为主，占118种。其次为抗肿瘤药物、抗炎/免疫类药物、神经系统药物、心血管系统药物、内分泌系统药物和代谢疾病药物，分别占40、19、12、9、8和3种，未分类药物占9种。排除抗感染药物后，针对具有金葡浮游菌生长抑制作用排名前十的小分子主要为抗肿瘤药物，其次为神经系统药物和未分类药物维生素K3，其抑制率均达99.65%~100%。针对具有金葡生物被膜抑制作用的排名前十小分子也以抗肿瘤药物占比最高，其次为神经系统药物和抗炎/免疫类药物，其抑制率为50.22%~92.95%。通过微量肉汤稀释实验检测了第二轮筛选得到的51个小分子的MIC。其中，主要包括抗肿瘤药物、心血管系统药物、内分泌系统药物、抗炎/免疫药物、代谢疾病药物、神经系统药物和其他未分类药物，分别占22、5、3、9、2、5和5种，其MIC分布分别为1.56~50 μmol/L、6.25~25 μmol/L、6.25~25 μmol/L、0.2~50 μmol/L、25~50 μmol/L、1.56~50 μmol/L和0.1~12.5 μmol/L。综上，通过高通量药物库筛选出的小分子最低抑菌浓度值均为微摩尔级别，成药能力强且可改造性高。其高效的浮游菌和生物被膜抗菌作用有望为针对金葡的新药研发提供新的思路。

目的:针对猫对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的高度易感性，筛选猫主要组织相容性复合物I类（major histocompatibility complex class I，MHC I）分子FLA-K*00701呈递SARS-CoV-2来源的多肽，并探索复合物制备方法，为研究猫感染SARS-CoV-2的T细胞免疫特征打下基础。方法:对可能与FLA-K*00701具有亲和力的SARS-CoV-2来源多肽进行预测并合成。采用稀释复性法，使猫白细胞抗原（feline leukocyte antigen，FLA）I类多肽复合物在体外合适环境下复性，纯化复合物后，用坐滴蒸汽扩散技术筛选晶体的生长条件，X射线衍射区分收集的蛋白结晶是否为晶体。结果:成功筛选到一条与FLA-K*00701具有高度结合能力的SARS-CoV-2来源多肽，并得到高纯度FLA-K*00701蛋白，初步筛选得到FLA多肽复合物晶体，X射线衍射分辨率为2.7?。结论:首次在SARS-CoV-2易感动物猫中筛选到与其FLA I具有高度亲和力的多肽，并得到高分辨率的复合物蛋白晶体，本研究为进一步探索猫抵抗SARS-CoV-2的细胞免疫机制及SARS-CoV-2多肽疫苗的研发提供有价值的参考。

目的:临床上已出现耐多黏菌素的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KPN),本研究分析耐多黏菌素KPN的药敏特征、流行病学特点,以及耐多黏菌素KPN产生的危险因素,以期为耐多黏菌素KPN感染的防治提供依据.方法:收集中南大学湘雅三医院(以下简称"本院")的30株耐多黏菌素KPN临床菌株,分析其药敏特点.采用胶体金免疫层析法检测样本中是否存在KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶;拉丝试验初筛高毒力KPN;结晶紫染色法检测生物膜形成能力;棋盘法进行联合药敏试验(多黏菌素B和美罗培南、替加环素、头孢哌酮/舒巴坦);PCR检测多黏菌素相关耐药基因;多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)进行基因分型和构建进化树.收集耐碳青霉烯类(carbapenem-resistant,CR)-KPN多黏菌素耐药菌株(23株,实验组)、CR-KPN多黏菌素敏感菌株(57株,对照组),对耐多黏菌素KPN产生的可能危险因素行单因素分析,再进一步行多因素Logistic回归分析.检测多黏菌素B和多黏菌素E的连续诱导耐药情况.结果:30株耐多黏菌素KPN中,28株为CR-KPN,CR-KPN均产KPC酶,4株拉丝实验阳性,多数菌株生物膜形成能力强.联合用药可有相加或协同效果.所有菌株均检出pmrA、phoP基因,未检测到mcr-1和mcr-2基因.MLST结果显示以ST11型为主.进化树表明耐多黏菌素的KPN未在本院形成医院暴发流行.使用过2种及以上不同类别的抗生素和使用过多黏菌素是多黏菌素耐药菌株产生的独立危险因素.连续使用多黏菌素可诱导耐药.结论:耐多黏菌素KPN对常用的抗菌药物几乎全部耐药,对其可采用以多黏菌素为基础的联合用药.在本院尚未分离出质粒介导的耐多黏菌素KPN.多黏菌素可诱导KPN形成耐药菌株,提示临床应合理使用抗菌药物,以延缓耐药性产生.

目的 通过制备木犀草素纳米混悬剂(luteolin nano-suspension,LNS),以提高木犀草素的水溶性、溶出速度和小肠吸收.方法 采用微沉淀-高压匀质法制备LNS,以粒径、稳定性、多分散指数(polydispersity index,PDI)、ζ电位为考察指标,通过单因素筛选法对处方进行了初步优化.采用动态光散射法、差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)和X射线粉末衍射(X-ray powder diffraction,XRPD)对纳米混悬剂进行表征,再采用桨法考察纳米混悬剂的体外溶出度,通过大鼠外翻肠模型实验,考察十二指肠、空肠、回肠和结肠不同部位的肠段对药物的吸收情况.结果 以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)作为稳定剂,稳定剂与药物质量比为1∶1时,可以制备得到粒径为210nm左右,分散性和储存稳定性良好的LNS;其ζ电位在(-16.30±0.78)mV,透射电子显微镜图显示,LNS呈均匀分散的球形或椭圆形纳米粒;DSC和XRPD研究结果表明,制备成LNS后,没有改变木犀草素的结晶状态;而体外溶出实验结果表明,LNS可以明显提高木犀草素的过饱和溶出度;外翻肠实验结果证实,LNS虽然不能改变木犀草素在小肠中的吸收部位,但可以大幅度提高木犀草素的吸收速率和吸收量.结论 所制备的LNS可以显著提高药物的水溶性、溶出速度和小肠吸收,用于木犀草素口服给药的潜在剂型.

目的 从30种常见非挥发性中药化学成分中筛选出对糠秕马拉色菌(Malassezia furfur,MF)抑制活性最强的两种化学成分,并对两者的协同抗菌作用及作用机制进行探究.方法 采用管碟琼脂扩散法对30种中药单体化合物的MF抑制活性进行初筛;采用96孔板培养联合固体培养基接种法,测定活性最强两种单体化合物、酮康唑(KTZ)及吡啶硫酮锌(ZPT)的最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)及其联合应用之后的联合最低杀菌浓度(combined minimum bactericidal concentration,CMBC),并计算联合杀 菌指数(fractional bactericidal concentration index,FBCI);采用结晶紫法测定活性成分对MF生物膜的影响;扫描电镜观察活性成分对MF外观形态的影响;CCK-8法检测活性成分对人永生角质形成细胞(HaCaT)的细胞毒性.结果 对MF抑制活性最强的两种化学成分分别为肉桂酸(CIN)和盐酸小檗碱(BER),在作用浓度为5.00 mg/mL时,两者抑菌圈直径分别为(15.17±2.37)mm和(11.21±1.03)mm.各样品的MBC大小顺序为:BER(2 500.00 μg/mL)＞CIN(156.25 μg/mL)＞ZPT(62.50 μg/mL)＞KTZ(7.81 μg/mL).FBCI试验结果表明:CIN和BER配伍,或者两者分别与KTZ或ZPT配伍,均具有协同杀菌的作用;CIN、BER、KTZ及ZPT相互配伍的CMBC分别为 39.06、625.00、1.95、15.62 μg/mL,FBCI 均为 0.5.各样品对 MF 生物膜抑制率的大小顺序为:CIN(93.08±1.15)％＞KTZ(65.10±4.23)％＞ZPT(43.00±2.81)％＞BER(10.55±1.21)％.扫描电镜结果显示,CIN组MF细胞结构完整,但是大部分菌体细胞壁出现不同程度的凹陷;BER、KTZ及ZPT组MF细胞结构完整,但是大部分菌体整体皱缩,细胞壁表面凹凸不平、粗糙.各样品对HaCaT细胞毒性的大小顺序为:ZPT(IC50＜10.00 μg/mL)＞BER[IC50=(27.83±0.66)μg/mL]＞KTZ[IC50=(28.22±0.14)μg/mL]＞CIN(IC50＞200.00 μg/mL).结论 CIN和BER具有协同抗MF的作用,它们分别与ZPT或KTZ联合应用也有协同抗MF作用;CIN的抗菌作用机制可能与抑制生物膜相关;两者均具有应用于祛头皮屑外用药品或日化产品中的潜质.

目的 探讨康替唑胺、利奈唑胺对常见革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的体外抗菌活性,初步分析其抑制生物被膜的相关机制.方法 取革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌,采用微量肉汤稀释法测定康替唑胺、利奈唑胺对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC).通过生长曲线检测不同药物浓度下细菌生长情况,在不抑制细菌生长的药物浓度下通过结晶紫染色观察细菌生物被膜形成情况及生物被膜内细菌存活率.采用蛋白质组学筛选康替唑胺、利奈唑胺作用下革兰阳性菌生物被膜差异表达蛋白,基因本体(GO)功能注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析差异表达蛋白功能,蛋白质相互作用网络(PPI)观察蛋白之间相互作用关系.结果 康替唑胺及利奈唑胺对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌表现出广谱抗菌活性,被选入实验所用菌株MIC均≤4 μg/mL,生长曲线结果显示康替唑胺、利奈唑胺在1/2×MIC并未影响细菌生长,结晶紫染色及生物被膜存活菌计数显示亚抑菌浓度下两种药物能够抑制金黄色葡萄球菌、粪肠球菌生物被膜形成;康替唑胺、利奈唑胺作用下革兰阳性菌生物被膜差异表达蛋白分别为290、222个,差异蛋白主要涉及rpmJ、rplE、SasG、luxS、ald1、D-丙氨酸氨基转移酶等.GO注释分析显示,康替唑胺作用下差异表达蛋白主要与丙酮酸代谢过程、氨基酸代谢等过程相关;利奈唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及嘧啶代谢过程、嘌呤代谢、氨基酸代谢等过程.KEGG分析显示,康替唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及萘降解、嘧啶代谢、糖酵解、核糖体切除修复等过程;利奈唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及氨基酸降解、脂肪酸降解、嘌呤代谢、戊糖和葡萄糖磷酸盐转化过程.PPI网络分析显示,两种抗生素作用下的差异表达蛋白主要与核糖体相关.结论 康替唑胺及利奈唑胺对革兰阳性菌表现出广谱抗菌活性及生物被膜抑制效果,两种药物可能通过抑制群体感应系统、初级代谢及生物被膜形成相关基因来抑制革兰阳性菌生物被膜形成.

目的:基于网络药理学和分子对接方法探讨甘草附子汤治疗类风湿性关节炎的作用机制.方法:利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology da-tabase,and analysis platform,TCMSP),根据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18的筛选条件,获取甘草附子汤中4味药材的化学成分和作用靶点;通过Gene-Cards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank等数据库获取类风湿性关节炎相关靶点,药物靶点与疾病靶点取交集得到甘草附子汤治疗类风湿性关节炎的潜在作用靶点;采用STRING在线平台构建潜在靶点PPI网络并获得GO富集分析及KEGG通路数据,对其作用机制进行分析预测.运用Cytoscape 3.7.2软件构建活性成分-核心靶点网络并对蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络进行拓扑分析.利用分子对接方法验证网络药理学分析甘草附子汤治疗RA结果的准确性.结果:活性成分-核心靶点网络分析结果显示有槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素等99种化学成分,关键靶点有白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、JUN、TNF、MAPK14等.GO富集分析共得到1912条富集结果,主要涉及对细胞因子产生的正调控、对炎症反应的调节、对脂多糖的反应等.KEGG富集分析共得到131条通路富集结果,主要涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、类风湿性关节炎、TNF信号通路、破骨细胞分化通路等;分子对接结果显示,度值排名前4的槲皮素、山柰酚、柚皮素、芒柄花素对接关键靶点的蛋白结晶复合物构象合理.结论:该研究初步表明,甘草附子汤中多种活性成分通过作用于IL-6、JUN、MAPK14等关键靶点,调节多条信号通路,下调炎性因子表达,调节骨代谢,干预骨破坏,调节免疫功能,发挥治疗类风湿性关节炎的作用.

目的 对倒心盾翅藤Aspidopterys obcordate藤茎的化学成分进行研究.方法 采用正相硅胶、反相ODS、MCI gel CHP20P等柱色谱及制备高效液相色谱等分离方法进行分离纯化,运用旋光、核磁共振、质谱和圆二色光谱等多种波谱学技术鉴定化合物的化学结构;并采用一水草酸钙结晶(COM)诱导的大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞损伤模型,对分离得到的单体成分进行活性筛选,初步探讨各单体成分对COM致NRK-52E细胞损伤的保护作用.结果 从倒心盾翅藤藤茎70％乙醇提取物中分离得到17个化合物,分别鉴定为槲皮素(1)、(+)-儿茶素(2)、异黄烷香豆素(3)、龙脑苷(4)、大柱香波龙烷-9-O-β-D-葡萄糖苷(5)、长春花糖苷Ⅱ(6)、2,3-seco-sonderianol(7)、木栓酮(8)、2α,3β,23-三羟基-12-烯-28-齐墩果酸(9)、(24S)-24-乙基胆甾-3β,5α,6β-三醇(10)、辛二酸单甲酯(11)、1-壬二酸甘油酯(12)、(9S,10E,12S,13S)-9,12,13-三羟基-10-十八碳烯酸(13)、(9S,10E,12S,13S,15Z)-三羟基十八烷-10,15-二烯酸(14)、异丙醇-[6-O-(β-D-木糖基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(15)、3,4-二羟基苯甲酰胺(16)和4'-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-维生素B5(17).结论 化合物3～5、7、9～17共13个化合物为首次从盾翅藤属中分离得到;并首次报道了化合物17的13C-NMR谱数据.其中,化合物1～3、10、13和14在不影响细胞活力的情况下,对COM所致NRK-52E细胞的损伤具有明显的抑制作用.

目的 建立 USCANNER(E)尿沉渣分析仪(简称 USE)常用参数参考区间;对其进行性能验证;分别比较 USE 和IQ200 尿沉渣分析仪(简称 IQ200)与人工镜检结果一致性.方法 筛选 331 例健康标本进行检测,建立常用参数参考区间;测定 USE携带污染率;另收集标本 147 例,同时用 USE 和 IQ200 检测,其中 92 例进行人工镜检.将 USE 分别与IQ200 和人工镜检作一致性分析,评估 USE诊断效能.结果 在 95%可信区间内 USE参考区间为:红细胞:0～6 个/μL(男),0～15 个/μL(女);白细胞:0～13 个/μL(男),0～22 个/μL(女);鳞状上皮细胞:0～8 个/μL(男),0～29 个/μL(女);非鳞状上皮细胞:0～1 个/μL(不分性别);管型、结晶、细菌及真菌为阴性.未检出携带污染.USE 与 IQ200 经人工修饰后红细胞、白细胞的Kappa值均≥0.85,其余项目在 0.54～0.72 之间.USE人工修饰后与人工镜检相比,除了非鳞状上皮细胞和结晶外,其余项目Kappa值均≥0.77.USE各项目符合率均≥88%;红细胞、白细胞、鳞状上皮细胞的受试者工作特征曲线的曲线下面积为 0.973、0.998、0.941.结论 本研究建立的 USE 参考区间可供参考;USE 对尿液有形成分的总体检测性能良好,适用于日常临床样本的初筛检查,但仍需配合人工镜检以提高结果的准确性.

目的 比较分析肾结石草酸钙晶体对人肾上皮细胞IncRNA的表达谱的影响,筛选差异表达的IncRNA并初步探讨其与肾结石的关系.方法 选取临床经结石成分分析为草酸钙的肾结石标本,充分研磨后配制草酸钙晶体悬液处理人肾上皮细胞HK-2细胞,通过MTT法测定草酸钙晶体对HK-2细胞生长的影响;提取总RNA并通过高通量转录组测序平台HiSeq 2500进行lncRNA表达谱差异性分析.对筛选获得的差异lncRNA进行Real-Time PCR验证,并通过Gene Ontology数据库和KEGG信号通路初步分析其功能.结果 草酸钙晶体在数分钟内便粘附于HK-2细胞表面,并且显示出明显的细胞毒性,细胞生长速度减慢且引起细胞形态以及培养基pH值发生显著改变.RNA seq结果显示经草酸钙晶体处理后的HK-2细胞中差异表达的lncRNA有25个,其中上调表达的9个,下调表达的16个.通过实时定量RT-PCR进行验证,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 草酸钙结晶对人肾上皮细胞lncRNA以及mRNA表达有显著影响,并且这些lncRNA的异常表达可能与肾结石发病有关.