目的 构建人源自噬微管相关蛋白轻链3A(microtubule-autophagy-related protein 1 light chain 3 A,mRFP-C1-LC3A)过表达质粒,并观察其在氯化钴(CoCl2)诱导的大鼠心肌细胞(H9C2细胞)缺氧模型中表达及抗凋亡机制.方法 利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术以cDNA文库为模板克隆人源轻链3A(light chain 3A,LC3A)基因,构建mRFP-C1-LC3A过表达质粒.通过0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2细胞,构建大鼠心肌细胞缺氧模型.应用Western-blot以及荧光成像技术检测细胞缺氧模型中的线粒体自噬水平的变化.通过Western-blot检测H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平不同对凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、胱天蛋白酶3(caspase-3)表达的影响.结果 质粒酶切、测序结果及Western-blot实验证明mRFP-C1-LC3A真核表达载体构建成功.Western-blot结果表明经 0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2 细胞后,细胞内低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF1α)蛋白表达上调、Hoechst/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色证实心肌细胞凋亡比例增加,缺氧模型构建成功(P<0.05).结合Western-blot以及荧光成像结果显示在H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平明显升高(P<0.05).通过巴佛洛霉素A1(BafA1)抑制线粒体自噬后,凋亡相关蛋白Bcl2表达下降、活化caspase-3表达升高,表明抑制线粒体自噬后,细胞凋亡水平进一步升高(P<0.05),Hoechst染色进一步明确结论.结论 成功构建人源LC3相关表达载体,并证实线粒体自噬可以抑制心肌细胞缺氧模型中的细胞凋亡.

目的:研究改性柑橘果胶（MCP）对兔关节软骨细胞的糖酵解代谢的影响。方法:分离、培养兔膝关节软骨细胞至第3代后，分别用含0、500 μg/ml MCP的培养液（MCP0和MCP500）培养3 d，设MCP0为对照组；连续传代培养软骨细胞，每代软骨细胞分别以MCP0和MCP500培养3 d；以白细胞介素-1β（IL-1β）处理软骨细胞1 d后，再分别用MCP0和MCP500培养3 d。以2-脱氧-葡萄糖（2DG）处理软骨细胞1 d后，再分别用MCP0和MCP500培养3 d；于培养3 d后，通过CCK-8方法检测软骨细胞的相对增殖情况；利用葡萄糖和乳酸检测试剂盒测定软骨细胞的葡萄糖摄取量和乳酸生成量；通过免疫荧光染色方法考察连续传代软骨细胞的Ⅱ型胶原α1（COL2A1）合成情况；采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测软骨细胞的 COL2A1、蛋白聚糖（ ACAN）、性别决定区Y框蛋白9（ SOX9）、缺氧诱导因子-1α（ HIF-1α）、葡萄糖转运蛋白-1（ Glut-1）、丙酮酸激酶M2（ PKM2）、乳酸脱氢酶A（ LDHA）和葡萄糖转运蛋白-3（ Glut-3）的基因表达情况。 结果:与对照组相比，MCP处理提高了软骨细胞的葡萄糖摄取量和乳酸生成量，上调了 ACAN、 HIF-1α、 Glut-1和 PKM2的基因表达水平；与对照组相比，连续传代过程中，MCP可以促进软骨细胞的增殖、维持软骨细胞的表型，上调 COL2A1、 ACAN、 SOX9、 HIF-1α、 Glut-1、P KM2和 LDHA的基因表达，提高软骨细胞COL2A1合成量和乳酸生成量；在经IL-β处理后，与对照组相比，MCP处理提高了软骨细胞的葡萄糖摄取量，上调了 COL2A1、 ACAN、 HIF-1α和 Glut-1的基因表达。在经2DG处理后，MCP处理提高了软骨细胞的葡萄糖摄取量，上调 SOX9、 HIF-1α、 PKM2和 Glut-3的基因表达。 结论:MCP能够增强软骨细胞的葡萄糖摄取能力，提高软骨细胞糖酵解代谢水平。

目的:探讨微小RNA-486-5p(miR-486-5p)通过调控缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶A(Akt)信号通路影响结肠癌的发生发展。方法:脂质体Lipofectamine? 3000将miR-486-5p模拟物NC(对照)，miR-486-5p模拟物转入SW480结肠癌细胞中，细胞购自上海细胞库。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-486-5p表达，噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期，Transwell实验检测细胞侵袭，蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、bcl-2相关蛋白X(bax)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p27、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、HIF-1α、PTEN、PI3K及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达。组间比较采用 t检验进行分析。 结果:miR-486-5p模拟物组细胞miR-486-5p表达量(1.87±0.09比1.00±0.10， t＝5.589， P<0.05)、细胞早期凋亡率[(15.48±0.97)%比(1.47±0.09)%， t＝4.327， P<0.05]，细胞晚期凋亡率[(27.46±1.54)%比(3.24±0.13)%， t＝5.652， P<0.05]，细胞周期G 1期[(60.32±4.43)%比(24.08±1.96)%， t＝4.578， P<0.05]、bax(0.96±0.08比0.18±0.01， t＝5.373， P<0.05)、p27(0.86±0.06比0.32±0.01， t＝5.762， P<0.05)及PTEN(1.64±0.09比0.46±0.02， t＝4.874， P<0.05)蛋白表达量高于对照组，miR-486-5p模拟物组细胞活力(0.33±0.01比0.54±0.03， t＝4.582， P<0.05)、细胞侵袭数目[(37.59±2.64)个比(179.93±6.96)个， t＝4.147， P<0.05]，bcl-2(0.21±0.01比1.04±0.09， t＝5.287， P<0.05)、Cyclin D1 (0.14±0.00比0.85±0.07， t＝4.642， P<0.05)、MMP-9(0.28±0.02比0.84±0.06， t＝4.643， P<0.05)、HIF-1α(0.45±0.03比1.53±0.09， t＝5.562， P<0.05)、PI3K(0.38±0.01比1.78±0.10， t＝5.468， P<0.05)及p-Akt(0.38±0.02比1.10±0.08， t＝4.129， P<0.05)蛋白表达量低于对照组。 结论:上调miR-486-5p表达量可诱导结肠癌细胞SW480凋亡、抑制细胞侵袭、使细胞周期发生阻滞，可能与抑制HIF-1α/PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。

目的:观察富里酸（FA）干预缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）基因表达谱的MiSeq测序分析结果。方法:体外培养hRMEC，并将其分为缺氧组（缺氧处理）和FA干预组（即缺氧后FA干预）。采用MTT比色法检测不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC活性的影响。选择FA的最佳作用浓度，通过实时荧光定量PCR （RT-PCR）验证FA对缺氧诱导hRMEC中细胞间黏附分子-1 （ICAM-1）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α、TNF-β等炎症因子及炎症相关因子mRNA表达的影响。收集处于对数生长期的缺氧组和FA干预组细胞，应用MiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序，获得生物学大数据，在此基础上分析差异表达的miRNA；通过基因注释（GO）功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。组间炎症因子及炎症相关因子表达比较时，通过miRNA mimic调节细胞中相应miRNA的表达水平，观察其对细胞功能的影响，从而判断该miRNA的作用。结果:不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC的细胞活性无影响。RT-PCT检测结果显示，缺氧组hRMEC中ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的mRNA表达较正常组明显上调，差异有统计学意义（ t=3.426、6.011、5.282、6.500 ， P=0.027、0.004、0.006、0.003）；FA干预组hRMEC中ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA表达较缺氧组明显下降，差异有统计学意义（ t=9.961、3.676、3.613、3.387， P=0.001、0.021、0.023、0.028 ）。缺氧组和FA干预组之间共有14个差异表达miRNA，其中上调基因9个，下调基因5个。共4个差异miRNA （hsa-miR-1 285-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3 170、hsa-miR-7 976）的预测靶基因均为ICAM-1。GO功能显著性富集分析结果显示，差异基因的功能主要富集在细胞发育、细胞分化和单生物发育过程中。KEGG通路显著性富集分析结果显示，差异miRNA表达高度富集的是癌症中蛋白多糖通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，差异表达较明显的是花生四烯酸代谢通路和安非他明成瘾性通路。 结论:FA可能通过调控多个miRNA的表达，影响下游ICAM-1 mRNA的表达水平，从而对缺氧刺激hRMEC后细胞的炎性状态产生影响。

目的:观察榄香烯注射液在食管癌围手术期治疗中的临床效果。方法:选取2017年1月至2018年7月于河北大学附属医院行手术治疗的食管癌患者180例，按照计算机产生的随机序列号分为试验组( n＝90)和对照组( n＝90)，试验组术中胸腔冲洗、淋洒留置榄香烯注射液并术后静脉滴注；对照组术中应用生理盐水胸腔冲洗。观察两组安全性指标、近期疗效指标、免疫指标、肿瘤标志物水平、远期获益指标。 结果:试验组白细胞增多、血小板减少、血红蛋白减少、肌酐升高、转氨酶升高、恶心呕吐发生率分别为43.33%(39/90)、0(0/90)、5.55%(5/90)、6.67%(6/90)、4.44%(4/90)、0(0/90)，对照组分别为53.33%(48/90)、1.11%(1/90)、2.22%(2/90)、4.44%(4/90)、7.78%(7/90)、1.11%(1/90)，两组差异均无统计学意义( χ2＝1.802， P＝0.179； P＝1.000； χ2＝0.595， P＝0.441； χ2＝0.424， P＝0.515； χ2＝0.871， P＝0.351； P＝1.000)。试验组术后拔管时间为(173.36±41.09)h，术后住院时间为(14.82±4.35)d，Karnofsky功能状态(KPS)评分为(81.43±3.89)分，对照组分别为(175.76±40.46)h、(15.34±5.22)d、(80.49±2.67)分，两组间差异均无统计学意义( t＝-0.395， P＝0.695； t＝-0.726， P＝0.472； t＝1.890， P＝0.061)。试验组引流液总量为(665.39±201.31)ml，吻合口瘘发生率为1.11%(1/90)，明显低于对照组的(732.67±213.84)ml和8.89%(8/90)，差异均具有统计学意义( t＝-2.173， P＝0.032； χ2＝4.211， P＝0.040)。治疗前，两组患者免疫功能指标差异均无统计学意义(均 P>0.05)。手术后1周复查，两组的CD3 ＋差异无统计学意义[(55.45±6.96)% vs. (53.71±6.54)%， t＝1.728， P＝0.087]；试验组的CD4 ＋、CD4 ＋/CD8 ＋、NK细胞较对照组升高，差异均有统计学意义[(29.43±5.05)% vs. (25.92±8.06)%， t＝3.501， P＝0.001；1.30±0.21 vs. 1.23±0.20， t＝0.229， P＝0.028；(254.20±15.21)个/μl vs. (237.05±10.73)个/μl， t＝2.741， P＝0.007]。试验组肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)水平分别为(1.37±0.18)ng/ml、(1.26±0.28)ng/ml、(0.89±0.17)ng/ml、(1.06±0.24)ng/ml，明显低于对照组的(2.86±0.42)ng/ml、(2.92±0.45)ng/ml、(2.38±1.55)ng/ml、(2.82±0.15)ng/ml，差异均具有统计学意义( t＝13.928， P＝0.014； t＝19.728， P＝0.011； t＝17.924， P＝0.006； t＝16.625， P＝0.003)。试验组患者1年复发率为2.22%(2/90)，半年死亡率为1.11%(1/90)，对照组分别为5.56%(5/90)和2.22%(2/90)，差异均无统计学意义( χ2＝0.595， P＝0.441； χ2＝0.000， P＝1.000)。 结论:榄香烯无瘤技术序贯治疗联合术后静脉滴注对于食管癌患者术后恢复有积极作用，可预防术后吻合口瘘的发生，改善患者免疫功能，降低肿瘤标志物水平，安全可行。

目的:探讨缺氧诱导因子-1α/Bcl-2/E1B-19kDa相互作用蛋白3（HIF-1α/BNIP3）介导的线粒体自噬对创伤性脑损伤（TBI）后神经元凋亡的影响。方法:选择HT22细胞（小鼠海马神经元）进行实验，采用氧糖剥夺复氧（OGD/R）的方法构建TBI的体外模型，通过HIF-1α、BNIP3特异性小干扰RNA（siRNA）或质粒载体转染细胞调节HIF-1α、BNIP3表达。实验1：研究BNIP3介导的线粒体自噬对TBI后神经元凋亡的影响。这部分实验中HT22细胞分为4组（ n=3）：siRNA对照组，转染阴性siRNA后正常培养；siRNA+TBI组，转染阴性siRNA后进行OGD/R处理；BNIP3-siRNA组，转染BNIP3-siRNA后正常培养；BNIP3-siRNA+TBI组，转染BNIP3-siRNA后进行OGD/R处理。实验终点通过Western blotting法检测HIF-1α、BNIP3及LC3-Ⅱ、P62等线粒体自噬相关蛋白的表达水平，透射电镜观察线粒体自噬小体，TUNEL染色法检测细胞凋亡率，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒测定细胞上清液LDH活性。实验2：研究HIF-1α对TBI后BNIP3介导的线粒体自噬及神经元凋亡的影响。这部分实验中HT22细胞分为8组（ n=3）：siRNA对照组及siRNA+TBI组，处理同上；HIF-1α-siRNA组，转染HIF-1α-siRNA后正常培养；HIF-1α-siRNA+TBI组，转染HIF-1α-siRNA后进行OGD/R处理；空载质粒组，转染空载质粒pcDNA3.1(+)后正常培养；过表达HIF-1α组，转染过表达HIF-1α质粒后正常培养；空载质粒+TBI组，转染空载质粒后进行OGD/R处理；过表达HIF-1α+TBI组，转染过表达HIF-1α质粒后进行OGD/R处理。实验终点测定各组细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平、细胞凋亡率及LDH活性。 结果:（1）实验1：与siRNA对照组比较，siRNA+TBI组BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高，P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著下降，细胞凋亡率及LDH活性显著升高，差异均有统计学意义（ P<0.05）。与siRNA+TBI组比较，BNIP3-siRNA+TBI组BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著下降，P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著升高，细胞凋亡率及LDH活性显著升高，差异均有统计学意义（ P<0.05）。透射电镜下siRNA+TBI组自噬小体较siRNA对照组增多，BNIP3-siRNA+TBI组自噬小体较siRNA+TBI组减少。（2）实验2：与siRNA+TBI组比较，HIF-1α-siRNA+TBI组HIF-1α、BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著下降，P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著升高，细胞凋亡率及LDH活性显著升高，差异均有统计学意义（ P<0.05）。与空载质粒+TBI组比较，HIF-1α过表达+TBI组HIF-1α、BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高，P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著下降，细胞凋亡率及LDH活性显著下降，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:HIF-1α通过促进BNIP3介导的线粒体自噬减轻TBI后神经元凋亡。

目的:探究缺氧是否通过肌醇依赖酶1α（inositol requires enzymes1α, IRE1α）介导的内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）激活应激活化蛋白激酶（JNK）通路参与调控小鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡。方法:体外培养小鼠肺动脉平滑肌细胞系（MPASMCs），构建缺氧MPASMCs模型，分别检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、ERS关键基因葡萄糖调节蛋白78（GRP78）以及JNK通路基因的表达；用siRNA转染敲低IRE1α表达，用JNK通路特异性抑制剂SP600125抑制JNK通路，XBP-1s质粒转染增加XBP-1s表达，CCK8实验以及增殖细胞核抗原（PCNA）检测观察细胞增殖水平，流式细胞分型以及凋亡相关基因B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2, BCL-2）、Bcl-2相关X蛋白(BAX)检测观察细胞凋亡水平。结果:缺氧培养后的MPASMCs中HIF-1α表达明显上调；在缺氧后GRP78、磷酸化IRE1α（P-IRE1α）以及磷酸化JNK（P-JNK）表达量均上升，提示IRE1α介导的ERS以及JNK通路被激活，Si-IRE1a抑制IRE1α表达后，P-JNK表达减低，说明JNK通路被抑制；缺氧组PCNA蛋白水平上调，结合CCK8实验提示细胞增殖水平上调，缺氧组促凋亡蛋白BAX表达下调，凋亡抑制基因BCL-2蛋白水平下调，结合流式细胞分型结果提示凋亡水平减低，SiIRE1a抑制IRE1α表达后，上述变化被延缓；用SP600125处理细胞后，也可部分延缓缺氧所引起的促增殖抗凋亡改变；常氧状态下过表达XBP-1s激活了JNK通路，同时出现了类似缺氧的改变。结论:缺氧激活IRE1α介导的内质网应激，进而通过JNK通路促进小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖并抑制其凋亡。

目的:研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）构象与唑来膦酸的关系，揭示唑来膦酸抑制血管形成的机制。方法:对唑来膦酸和VEGF结构进行预处理，模拟分子对接，精确筛选两者最佳的结合构象。细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）法、体内、外血管生成、免疫荧光和蛋白质印迹法等方法检测不同浓度唑来膦酸（A组为0 μmol/L，B、C、D组分别为25、50和100 μmol/L）对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的增殖、血管形成及成血管相关分子的影响。结果:靶蛋白VEGF构象上存在唑来膦酸结合位点，亲和能为-5.2 kcal/mol，由氨基酸Cys26，51，57等构成的疏水区域和A链（ASP34，SER50）、B链（CYS61、68，LEU66，GLY59）等构成的氢键结合区域组成。CCK-8结果显示，3~6 d各个时间点B、C、D组的 A值均显著低于A组（ P<0.05）；体外血管实验显示，B、C、D组出芽数［分别为（208±28）、（151±21）和（62±9）个］均显著低于A组［（276±30）个］（ P<0.05）；体内血管实验显示，A组Matrigel凝胶/血浆荧光比值（0.003 1±0.000 3）显著高于B组（0.002 1±0.000 2）、C组（0.001 6±0.000 2）和D组（0.000 6±0.000 1）（ P<0.05）；蛋白质印迹法结果显示，B、C、D组VEGF的表达量［分别为（0.72±0.11）、（0.41±0.07）和（0.24±0.04）］均显著低于A组（1.01±0.02）（ P<0.05）；B、C、D组缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达量［分别为（0.68±0.09）、（0.55±0.06）和（0.43±0.08）］均显著低于A组（0.96±0.04）（ P<0.05）。 结论:唑来膦酸可抑制HUVEC细胞增殖、体内、外血管形成及VEGF/HIF-1α的表达。VEGF构象上存在与唑来膦酸结合位点，位于氨基酸的疏水区域和氢键结合区域，设计针对此位点的拮抗剂有潜在缓解唑来膦酸抑制血管生成的作用。

目的:从蛋白质泛素/类泛素化修饰平衡角度探讨白藜芦醇抑制皮肤鳞状细胞癌新生血管形成的内在机制。方法:以人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株为研究对象，分别给予培养基中加入50 μmol/L和100 μmol/L白藜芦醇处理对数生长期A431细胞作为实验组，以不加白藜芦醇培养基处理为对照组。按照上述实验分组，培养48 h采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测各组细胞增殖活性；采用血管模拟形成实验检测白藜芦醇处理12 h对A431细胞血管拟态形成能力的影响；采用Western印迹检测白藜芦醇处理48 h各组细胞泛素（ubiquitin）、小泛素相关修饰蛋白1（SUMO1）、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子受体（VEGFR）相对表达水平。将24只8周龄BALB/c雄性去胸腺小鼠随机均分3组，于腹股沟皮下接种A431细胞，治疗组予1 mg/kg或2 mg/kg白藜芦醇腹腔注射给药，对照组注射相同体积的生理NaCl溶液，每3天注射1次，第21天处死小鼠，解剖肿瘤称重；采用免疫组化检测各组肿瘤组织中CD31的表达。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:对照组、50 μmol/L组、100 μmol/L组A431细胞增殖率差异有统计学意义（ F = 17.75， P = 0.017），50 μmol/L组、100 μmol/L组低于对照组（66.53% ± 5.09%、35.88% ± 4.28%比100%，LSD- t = 21.17、29.04， P = 0.011、0.004）；3组A431细胞血管管壁样细胞嵴的总长度差异有统计学意义（ F = 21.37， P = 0.004），50 μmol/L组、100 μmol/L组低于对照组[（102.73 ± 11.36）μm、（37.83 ± 4.19）μm比（185.26 ± 8.02）μm，均 P < 0.05]；3组细胞泛素、SUMO1、HIF-1α、VEGFR相对表达差异均有统计学意义，50 μmol/L组、100 μmol/L组泛素相对表达均高于对照组（2.09 ± 0.13、3.53 ± 0.16比0.68 ± 0.11，均 P < 0.05），SUMO1、HIF-1α、VEGFR的相对表达均低于对照组（SUMO1：1.87 ± 0.13、1.02 ± 0.11比3.10 ± 0.11，HIF-1α：0.81 ± 0.06、0.45 ± 0.06比0.97 ± 0.08，VEGFR：0.73 ± 0.09、0.39 ± 0.05比0.98 ± 0.07，均 P < 0.05）。动物试验中，对照组、1 mg/kg组、2 mg/kg组小鼠皮下肿瘤质量[（3.29 ± 0.57）g、（2.91 ± 0.49）g、（2.55 ± 0.52）g]、肿瘤组织CD31细胞阳性率（76.24% ± 5.51%、39.45% ± 5.48%、12.07% ± 3.54%）差异均有统计学意义（ F = 14.33、15.34， P = 0.019、0.021），1 mg/kg组、2 mg/kg组均低于对照组（均 P < 0.05）。 结论:白藜芦醇能够抑制肿瘤生长与肿瘤组织新生血管形成，可能与通过降低HIF-1α蛋白泛素/类泛素化修饰途径抑制皮肤鳞癌新生血管形成有关。

目的:研究脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，ASCs)来源外泌体抑制高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)/核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)诱导心肌细胞损伤的影响。方法:购买ASCs细胞株、心肌H9c2细胞株，培养并鉴定ASCs并分离外泌体；培养心肌H9c2细胞并建立H/R损伤模型。将H9c2细胞分为对照组、H/R组、外泌体+H/R组。为验证HMGB1/NF-κB途径在外泌体减轻心肌细胞损伤中的作用，H9c2细胞被分为Ad-NC组、Ad-NC+H/R组、Ad-NC+H/R+外泌体组、Ad-HMGB1+H/R+外泌体组。检测各组细胞存活率、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、磷酸肌酸激酶( creatine phosphate kinase，CPK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及HMGB1、NF-κB表达水平。结果:透视电镜及特异性蛋白CD9与CD63检测显示成功获得了ASCs并分离外泌体。外泌体2 μg/mL及细胞培养48 h分别为本研究的ASCs来源外泌体浓度及培养时间。与对照组、H/R+外泌体组比较，H/R组细胞存活率明显降低，细胞培养基中LDH、AST、CPK、IL-1β、TNF-α、MDA的含量明显增加，细胞中HMGB1、NF-κB的表达水平明显增加，组间差异均具有统计学意义( F值分别为64.81、81.38、77.38、94.71、53.82、71.38、49.57、29.59、41.38， P值均<0.05)。过表达HMGB1后，Ad-NC组、Ad-NC+H/R组及Ad-HMGB1+H/R+外泌体组细胞中HMGB1和NF-κB的表达水平较Ad-NC+H/R+外泌体组明显升高，组间差异具有统计学意义[(0.42±0.07)比(0.93±0.17)比(0.78±0.14)比(0.34±0.08)，(0.48±0.08)比(0.84±0.15)比(0.89±0.17)比(0.37±0.06)， F值分别为83.91、77.59， P值均<0.05]。与Ad-NC+H/R组比较，Ad-NC组、Ad-NC+H/R+外泌体组及Ad-HMGB1+H/R+外泌体组的细胞存活率明显升高，培养基中LDH、AST、CPK的含量明显降低，组间差异有统计学意义[ F值分别为71.85，103.85，88.47，115.49， P值均<0.05]；Ad-NC+H/R+外泌体组细胞存活率较Ad-HMGB1+H/R+外泌体组明显降低，培养基中LDH、AST、CPK的含量则较之明显增加，差异均有统计学意义[%：(81.25±9.77)比(53.23±8.12)，U/mL：(367.68±61.32)比(603.38±87.67)，U/mL：(26.34±5.18)比(40.38±9.12)，U/mL：(2.46±0.57)比(5.22±0.74)， P值均<0.05]。与Ad-NC组比较，Ad-NC+H/R组、Ad-NC+H/R+外泌体组及Ad-HMGB1+H/R+外泌体组细胞培养基中IL-1β、TNF-α、MDA含量明显升高，组间差异有统计学意义[ng/mL：(1.77±0.35)比(5.45±0.89)比(2.67±0.42)比(5.08±0.77)，ng/mL：(3.56±0.73)比(9.23±1.18)比(5.24±0.87)比(8.62±1.09)，μmol/mL：(0.91±0.14)比(2.15±0.45)比(1.31±0.27)比(1.89±0.29)， F值分别为91.58，83.58，64.84， P值均<0.05]。 结论:ASCs来源外泌体具有减轻心肌细胞H/R损伤的作用，这一作用与抑制HMGB1/NF-κB途径介导的炎症反应及氧化应激反应有关。