目的:从蛋白质类泛素化修饰角度解析亚低温对神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的保护机制，为新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）的亚低温治疗提供科学依据。方法:原代分离培养小鼠NSCs，分为对照组、缺氧组、亚低温组、缺氧+亚低温组并予相应处理，Western Blot法检测小泛素相关修饰蛋白2/3（small ubiquitin-related modifier 2/3，SUMO2/3）、低氧诱导因子1 α（hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1 α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 α，PGC-1α）和八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）的蛋白水平；比较NSCs克隆球直径变化，酶联免疫吸附法检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量，流式细胞术检测细胞凋亡率，免疫荧光法检测NSCs向神经元细胞分化情况。结果:与对照组相比，缺氧组NSCs中SUMO2/3、HIF-1α和PGC-1α的蛋白水平分别升高至1.33、2.26和2.40倍，亚低温组NSCs中SUMO2/3和PGC-1α的蛋白表达水平分别升高至1.52倍和6.36倍，差异均有统计学意义（ P<0.05）；与缺氧组相比，缺氧+亚低温组NSCs中SUMO2/3、HIF-1α、PGC-1α和Oct4的蛋白表达水平分别升高至1.44、1.40、3.30和1.59倍，差异均有统计学意义（ P<0.05）。缺氧组、亚低温组、缺氧+亚低温组细胞克隆球直径明显小于对照组，缺氧+亚低温组细胞克隆球直径明显小于缺氧组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。亚低温组与对照组LDH水平比较差异无统计学意义（ P>0.05），缺氧+亚低温组LDH水平明显低于缺氧组（ P<0.05）。亚低温组细胞死亡率与对照组比较差异无统计学意义（ P>0.05），缺氧+亚低温组细胞死亡率明显低于缺氧组（ P<0.05）。与对照组相比，缺氧组和亚低温组巢蛋白表达水平均有所升高，但神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）水平明显下降（ P<0.05）；与缺氧组和亚低温组相比，缺氧+亚低温组巢蛋白表达水平进一步增强，同时NSE表达水平进一步下降（ P<0.05）。 结论:亚低温可能通过强化蛋白质的SUMO化修饰方式增加NSCs对缺氧的耐受，进一步为亚低温治疗HIE提供了理论依据。

目的:从蛋白质泛素/类泛素化修饰平衡角度探讨白藜芦醇抑制皮肤鳞状细胞癌新生血管形成的内在机制。方法:以人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株为研究对象，分别给予培养基中加入50 μmol/L和100 μmol/L白藜芦醇处理对数生长期A431细胞作为实验组，以不加白藜芦醇培养基处理为对照组。按照上述实验分组，培养48 h采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测各组细胞增殖活性；采用血管模拟形成实验检测白藜芦醇处理12 h对A431细胞血管拟态形成能力的影响；采用Western印迹检测白藜芦醇处理48 h各组细胞泛素（ubiquitin）、小泛素相关修饰蛋白1（SUMO1）、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子受体（VEGFR）相对表达水平。将24只8周龄BALB/c雄性去胸腺小鼠随机均分3组，于腹股沟皮下接种A431细胞，治疗组予1 mg/kg或2 mg/kg白藜芦醇腹腔注射给药，对照组注射相同体积的生理NaCl溶液，每3天注射1次，第21天处死小鼠，解剖肿瘤称重；采用免疫组化检测各组肿瘤组织中CD31的表达。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:对照组、50 μmol/L组、100 μmol/L组A431细胞增殖率差异有统计学意义（ F = 17.75， P = 0.017），50 μmol/L组、100 μmol/L组低于对照组（66.53% ± 5.09%、35.88% ± 4.28%比100%，LSD- t = 21.17、29.04， P = 0.011、0.004）；3组A431细胞血管管壁样细胞嵴的总长度差异有统计学意义（ F = 21.37， P = 0.004），50 μmol/L组、100 μmol/L组低于对照组[（102.73 ± 11.36）μm、（37.83 ± 4.19）μm比（185.26 ± 8.02）μm，均 P < 0.05]；3组细胞泛素、SUMO1、HIF-1α、VEGFR相对表达差异均有统计学意义，50 μmol/L组、100 μmol/L组泛素相对表达均高于对照组（2.09 ± 0.13、3.53 ± 0.16比0.68 ± 0.11，均 P < 0.05），SUMO1、HIF-1α、VEGFR的相对表达均低于对照组（SUMO1：1.87 ± 0.13、1.02 ± 0.11比3.10 ± 0.11，HIF-1α：0.81 ± 0.06、0.45 ± 0.06比0.97 ± 0.08，VEGFR：0.73 ± 0.09、0.39 ± 0.05比0.98 ± 0.07，均 P < 0.05）。动物试验中，对照组、1 mg/kg组、2 mg/kg组小鼠皮下肿瘤质量[（3.29 ± 0.57）g、（2.91 ± 0.49）g、（2.55 ± 0.52）g]、肿瘤组织CD31细胞阳性率（76.24% ± 5.51%、39.45% ± 5.48%、12.07% ± 3.54%）差异均有统计学意义（ F = 14.33、15.34， P = 0.019、0.021），1 mg/kg组、2 mg/kg组均低于对照组（均 P < 0.05）。 结论:白藜芦醇能够抑制肿瘤生长与肿瘤组织新生血管形成，可能与通过降低HIF-1α蛋白泛素/类泛素化修饰途径抑制皮肤鳞癌新生血管形成有关。

目的:评价电针预处理对大鼠脑缺血再灌注时皮质Ubc9表达的影响。方法:清洁级健康雄性SD大鼠80只，8～12周龄，体重200～250 g，按照随机数字表法分为4组( n＝20)：假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、电针预处理组(E组)和假电针组(SE组)。S组仅暴露颈部血管，不插入线栓阻闭；其余3组采用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，栓塞2 h后拔出线栓恢复灌注。E组和SE组造模前5 d行电针刺激，E组选取百会穴(大鼠头顶部两耳连线中点)电针刺激，参数为2/12 Hz疏密波，强度1 mA，30 min/d，连续5 d，最后1次电针刺激24 h后造模，SE组选取刺激点为百会穴旁开1 cm，其余操作参数同E组。于再灌注24和48 h时行神经功能缺陷评分，随后处死大鼠取大脑皮质缺血半暗带组织，TUNEL法检测细胞凋亡情况并计算凋亡率，Western blot法检测Ubc9和结合状态小泛素样修饰蛋白(SUMO)2/3的表达。 结果:与S组比较，其余3组再灌注24和48 h时神经功能缺陷评分和皮质细胞凋亡率升高，Ubc9和结合状态SUMO2/3表达上调( P<0.05)；与I/R组和SE组比较，E组再灌注24和48 h时神经功能缺陷评分和皮质细胞凋亡率降低，Ubc9和结合状态SUMO2/3表达上调( P<0.05)。 结论:电针预处理减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的机制与进一步上调Ubc9表达，从而增强SUMO2/3化修饰有关。

目的:评价选择性脑亚低温对大鼠脑缺血再灌注时动力相关蛋白1(Drp1)小泛素样修饰蛋白2/3(SUMO2/3)化修饰的影响。方法:清洁级健康雄性SD大鼠60只，6~8周龄，体质量240~260 g，采用随机数字表法分为4组( n＝15)：假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、选择性脑亚低温组(HT组)和常温组(NT组)。4组大鼠在监测脑温及直肠温度下进行操作，S组仅暴露颈部动脉；其余3组采用阻塞大脑中动脉2 h恢复灌注的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。HT组和NT组拔除线栓即刻于左侧颈内动脉以80 ml·kg -1·h -1的速率分别灌注4和37 ℃生理盐水15 min。于再灌注24 h时行改良神经功能缺损严重程度评分(mNSS)。随后对大鼠实施深麻醉断头取脑，TTC染色观察并计算脑梗死体积百分比；取脑皮质缺血半暗带组织，透射电镜下观察线粒体超微结构改变，免疫共沉淀法检测Drp1 SUMO2/3化修饰水平，Western blot法检测总Drp1(T-Drp1)和总细胞色素c(T-Cytc)表达，分离线粒体和胞浆后检测线粒体外膜Drp1(M-Drp1)和胞浆Cytc(C-Cytc)表达。 结果:与S组比较，其余3组mNSS和脑梗死体积百分比升高，M-Drp1、T-Drp1、C-Cytc和T-Cytc表达上调，Drp1 SUMO2/3化修饰水平升高( P<0.05)，线粒体碎片化加重，嵴断裂和空泡化明显；与I/R组比较，HT组mNSS和脑梗死体积百分比降低，M-Drp1、T-Drp1、C-Cytc和T-Cytc表达下调，Drp1 SUMO2/3化修饰水平升高( P<0.05)，线粒体碎片化减轻、嵴断裂和空泡化减弱。NT组各指标与I/R组比较差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:选择性脑亚低温减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的机制与进一步增加Drp1 SUMO2/3化修饰水平，降低Drp1与线粒体外膜结合，减少线粒体过度分裂有关。

目的:探讨通过诱导蛋白质广泛去类泛素化修饰途径抑制子宫内膜癌的干性维持潜能，达到子宫内膜癌侧群细胞化疗增敏的目的。方法:流式细胞术分选培养CD133 +CD44 +的KLE子宫内膜癌侧群细胞克隆球，Western blot法检测小泛素相关修饰蛋白1(SUMO1)及肿瘤侧群细胞干性维持基因八聚体结合转录因子4(Oct4)和性别决定区Y-box2(Sox2)蛋白的表达情况。慢病毒介导KLE侧群细胞稳定转染SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)基因，Western blot法检测SENP1、SUMO1、Oct4和Sox2的蛋白表达；比较过表达与未过表达SENP1基因的KLE侧群细胞克隆形成率，流式细胞术检测细胞周期变化，四甲基偶氮唑蓝实验和流式细胞术检测子宫内膜癌侧群细胞对顺铂的化疗敏感性，子宫内膜癌荷瘤鼠模型检测SENP1过表达对顺铂的化疗敏感性影响。 结果:CD133 +CD44 +和CD133 -CD44 -子宫内膜癌KLE细胞克隆形成率分别为(23.64±5.03)%和(4.64±1.25)%，差异有统计学意义( P＝0.003)，CD133 +CD44 +子宫内膜癌KLE细胞中SUMO1、Oct4和Sox2蛋白表达水平高于CD133 -CD44 -子宫内膜癌KLE细胞(均 P<0.05)。与未转染SENP1基因的KLE侧群细胞比较，SENP1过表达的KLE侧群细胞SUMO1、Oct4、Sox2蛋白表达水平降低，细胞克隆形成率由(25.67±5.44)%下降至(7.46±1.42)%，细胞周期发生由G 0/G 1期向G 2期的偏移，顺铂半数抑制浓度由(55.46±6.14) μg/ml下降至(11.55±3.12) μg/ml，细胞凋亡率由(9.76±2.09)%上升至(16.79±3.44)%，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。过表达SENP1能够降低KLE侧群细胞增殖能力，增加化疗敏感性。 结论:通过过表达SENP1能够诱导蛋白质去SUMO化修饰，抑制子宫内膜癌侧群细胞的干性维持潜能，进而增强其化疗敏感性。

目的:运用分子生物学方法观察小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-related modifier，SUMO）通路成员在骨肉瘤中的表达特点，为基于蛋白质SUMO化修饰的靶向治疗提供理论依据。方法:收集2017年1月至2019年6月于我院就诊并手术的新鲜骨肉瘤组织样本18例，经Western blot及免疫组织化学方法检测癌灶及癌旁SUMO通路核心成员SUMO1、SAE1、Ubc9、SENP1的蛋白表达水平。分别干涉SUMO1、干涉UBC9及过表达SENP1，进行如下分组：空白对照组、对照组、siR-SUMO1组、siR-Ubc9组和SENP1组。Western blot验证基因转染效率，细胞增殖检测试剂盒检测EdU的阳性表达率，划痕实验及Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡率。以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为研究对象，评估三种治疗方案的副作用。结果:Western blot及免疫组织化学结果均显示，骨肉瘤组织中SUMO1、SAE1、Ubc9的蛋白表达水平均明显高于癌旁组织（ P<0.05），但SENP1明显低于癌旁组织。基于143B骨肉瘤细胞的实验结果表明，siR-SUMO1组、siR-Ubc9组、SENP1组均能够明显抑制骨肉瘤细胞中SUMO通路的活化，表现为较对照组和无义组更低的肿瘤细胞增殖率（ P<0.05），更低的细胞迁移和侵袭能力（ P<0.05），以及更高的细胞凋亡率（ P<0.05）；然而基于BMSCs的实验结果表明，siR-SUMO1组和siR-Ubc9组能够明显抑制BMSCs的增殖，诱导细胞凋亡，表现出极大的治疗副作用，但SENP1组对BMSCs的增殖和凋亡几乎没有影响（ P>0.05）。 结论:SUMO通路在骨肉瘤中被异常激活，外源性补充或内源性激活SENP1是靶向治疗的备选方案之一。

牙髓干细胞(DPSC)是从牙髓中分离的、具有高分化潜能的多能干细胞，通过DPSC进行血管再生也许是一个不错的选择。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是血管内皮生长因子(VEGF)的上游基因，小泛素修饰物蛋白酶1(SENP1)能够逆转HIF-1α的小泛素样(SUMO)修饰。通过SENP1/HIF-1α的调控，在许多体内外实验中都表现出了良好的血管再生特性。SENP1/HIF-1α信号轴对许多实体肿瘤有着不同程度的促进及抑制作用，目前虽然SENP1/HIF-1α信号轴在牙髓干细胞内作用的相关文献相对较少，但能够确定SENP1/HIF-1α对牙髓干细胞的血管生成方面起到重要作用。本文将阐述SENP1/HIF-1α信号通路，及其促进DPSC成血管分化的作用机制。

目的:探讨神经纤维瘤蛋白1（NF1）在胆囊癌中的机制。方法:采用实验研究方法。培养人胆囊癌细胞系GBC-SD、NOZ、SGC996、EH-GB1、ZJU0428，人胚肾细胞系293T，人宫颈癌细胞系HELA；构建免疫共沉淀实验所需的重组质粒mRFP-YAP1 FL-FLAG和eGFP-MYC-NF1 2650~2750-HA，体外纯化Yes相关蛋白1（YAP1）截断体蛋白和NF1融合蛋白。分别采用等温滴定量热实验、GST pull-down实验、免疫共沉淀实验、免疫荧光和激光共聚焦检测NF1与YAP1的体内外相互作用，采用蛋白质免疫印迹法检测不同胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。观察指标：（1）NF1与YAP1的体外相互作用。（2）NF1与YAP1的细胞内相互作用。（3）不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。结合解离常数由ITC200等温滴定量热仪自带软件输出，以 x±s表示。计数资料以绝对值表示。 结果:（1）NF1与YAP1的体外相互作用。①等温滴定量热实验结果显示：PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的第1个WW1结构域蛋白存在相互作用，结合解离常数为（0.42±0.06）mmol/L；PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的162~275蛋白区段存在相互作用，结合解离常数为（0.69±0.14）mmol/L。②GST pull-down实验结果显示：相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1 WW1反应体系，在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1 WW1反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1 WW1；相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1 WW2反应体系，在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1 WW2反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1 WW2。（2）NF1与YAP1的细胞内相互作用。①免疫共沉淀实验结果显示：在使用FLAG凝胶珠孵育共转染mRFP-YAP1 FL-FLAG和eGFP-MYC-NF1 2650~2750-HA的细胞裂解液中，观察到NF1蛋白的免疫印迹。②免疫荧光和激光共聚焦检测结果显示：在人胆囊癌细胞系NOZ的原位荧光中，YAP1和NF1荧光明显，主要定位于细胞质中。在人胆囊癌细胞系SGC996的原位荧光中，YAP1荧光明显，主要定位于细胞核中，NF1荧光不明显。（3）不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。蛋白印迹实验结果显示：以人宫颈癌细胞系HELA中NF1蛋白的表达量为标准，在人胆囊癌细胞系EH-GB1、GBC-SD、NOZ、SGC996、ZJU0428中，NF1蛋白的相对表达量分别为1.28、0、1.01、0、0。 结论:NF1可能通过直接作用于YAP1蛋白影响胆囊癌。

目的:评价小泛素相关修饰物(SUMO) E3连接酶(PIAS)调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的SUMO化修饰在小鼠内毒素性急性肺损伤(ALI)内源性保护机制中的作用。方法:实验Ⅰ　清洁级野生型雄性C57BL/6小鼠24只，6~8周龄，体质量18~22 g，采用随机数字表法分为4组( n＝6)：对照组(C组)、ALI组、ALI+ PPARγ诱导剂TZD组(ALI+T组)、ALI+TZD+SUMO化抑制剂漆树酸组(ALI+T+A组)。尾静脉注射LPS 15 mg/kg制备内毒素性ALI模型。ALI+T+A组注射LPS前1 h时腹腔注射漆树酸5 mg/kg；ALI+T组和ALI+T+A组注射LPS前30 min时腹腔注射TZD 50 mg/kg。给予LPS 12 h后处死小鼠取肺组织，测定湿重/干重(W/D)比值，光镜下观察病理学结果，并行肺损伤评分；分别采用Western blot法和PCR法测定PIAS1、PIAS2、PIAS3和PIASy及其mRNA的表达。实验Ⅱ 　体外培养的小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)采用随机数字表法分为4组( n＝5)：对照组(C组)、LPS组(L组)、LPS+ PIAS2 siRNA组(L+P组)和LPS+Con siRNA组(L+C组)。C组常规培养，余3组给予10 μg/ml LPS刺激MH-S细胞，制备内毒素攻击模型。L+P组和L+C组于加入LPS前48 h时分别转染50 nmol/L PIAS2 siRNA或Con siRNA。加入LPS孵育24 h时收集细胞，检测细胞活力；采用流式细胞术检测肺泡M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞水平，计算M1型/M2型比值；釆用Western blot法检测PIAS2和PPARγ表达，采用免疫共沉淀法测定PPARγ-SUMO1共表达；采用PCR测定TNF-α和IL-10的mRNA表达。 结果:实验Ⅰ　与C组比较，其余3组肺损伤评分和肺组织W/D比值升高，PIAS2及其mRNA表达上调( P<0.05)；与ALI组比较，ALI+T组和ALI+T+A组肺损伤评分和肺组织W/D比值降低，PIAS2及其mRNA表达上调( P<0.05)；与ALI+T组比较，ALI+T+A组肺损伤评分和肺组织W/D比值升高，PIAS2及其mRNA表达下调( P<0.05)。4组间肺组织PIAS1、PIAS3和PIASy及其mRNA表达差异无统计学意义( P>0.05)。实验Ⅱ与C组比较，其余3组细胞活力降低，PPARγ表达和PPARγ-SUMO1共表达上调，M1型和M2型巨噬细胞水平、M1/M2型比值升高，TNF-α mRNA表达上调，IL-10 mRNA表达下调，L组和L+C组细胞PIAS2表达上调( P<0.05)；与L组比较，L+P组细胞活力下降，PIAS2、PPARγ表达和PPARγ-SUMO1共表达下调，M1型巨噬细胞水平和M1型/M2型比值升高，TNF-α mRNA表达上调，IL-10 mRNA表达下调( P<0.05)，L+C组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)；与L+C组比较，L+P组细胞活力下降，PIAS2、PPARγ表达和PPARγ-SUMO1共表达下调，M1型肺泡巨噬细胞水平和M1型/M2型比值升高，TNF-α mRNA表达下调，IL-10 mRNA表达上调( P<0.05)。 结论:PIAS2调控PPARγ的SUMO化修饰是小鼠内毒素性ALI的内源性保护机制，可能与抑制巨噬细胞向M1型极化，减轻炎症反应有关。

目的:探究SUMO E3连接酶(zinc finger protein 451，ZNF451)介导非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞DNA损伤修复的功能及机制。方法:采用γ射线或依托泊苷处理A549细胞和HeLa细胞，CCK-8法检测细胞增殖活力，蛋白免疫印迹法检测蛋白表达量。DR-GFP质粒系统检测DNA损伤修复水平，免疫荧光法检测蛋白的空间定位。结果:依托泊苷抑制了ZNF451的表达并呈剂量及时间依赖性。30、50、80 μmol/L依托泊苷处理，敲低ZNF451后的A549和HeLa细胞增殖活力显著降低(A549： t ＝ 27.62、25.61、5.32, P<0.01；HeLa： t ＝ 30.77、21.28、4.18， P<0.01)。ZNF451在DNA损伤位点处募集并与γ-H2AX存在胞内共定位和内源性的相互作用，且在30、50、80 μmol/L依托泊苷处理的ZNF451敲低细胞中，γ-H2AX的表达水平显著增加(A549： t ＝ 6.12、10.67、4.68， P<0.01；HeLa： t ＝ 7.94、9.81、15.12， P<0.01)。敲低ZNF451的细胞非同源末端连接(NHEJ)修复效率降低( t ＝ 18.60， P<0.05)。在辐射和依托泊苷处理后，ZNF451与P53结合蛋白1(53BP1)和DNA损伤检查点介质1(MDC1)有明显的共定位。 结论:敲低ZNF451抑制A549和HeLa细胞增殖并诱导DNA损伤水平加剧。ZNF451可以募集至DNA损伤位点，通过与DNA损伤修复因子53BP1/MDC1共定位参与NHEJ修复。