《2020年罕见病变异分类ACGS最佳实践指南》是临床基因组科学协会(ACGS)下属的英国医学遗传学会在美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)和分子病理学协会(AMP)2015年发布的序列变异解读的标准和指南的基础上，整合了截至2020年美国ClinGen序列变异解读(SVI)工作组开发的标准细则，制定的补充性实践指南。ACMG/AMP指南的进一步发展目前由美国ClinGen SVI工作组负责，这些指南侧重于对高外显率、蛋白编码变异的分类。对需要不同证据阈值的疾病，ClinGen已建立了许多特定疾病变异专家小组，并正在制定疾病/基因特异性指南。英国医学遗传学会对序列变异分类指南及其延伸的细则进行了信息收集和整合，形成了自己的《罕见病变异分类ACGS最佳实践指南》并定期更新，笔者对2020年版本进行了翻译和总结，以供广大医学遗传学工作者参阅。

目的:研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing，QS)系统核心调控子OpaR对 pilABCD的转录。 方法:提取副溶血弧菌野生株(wild-type，WT)和 opaR突变株(Δ opaR)的总RNA，采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)研究OpaR对 pilA( pilABCD首基因)的转录调控；将 pilABCD上游调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游，构建LacZ重组质粒，并将该重组质粒转入WT和Δ opaR中制备LacZ菌株，通过LacZ报告基因融合试验研究OpaR对 pilA的调控以及 pilA的时相表达。提取WT株总RNA，采用引物延伸试验研究 pilABCD的转录起始位点；PCR扩增 pilABCD上游调控区DNA序列，并纯化His-OpaR蛋白，通过凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)研究His-OpaR与靶DNA片段是否有直接的结合作用，并进一步采用DNaseⅠ足迹试验分析其结合位点。 结果:qPCR和LacZ报告基因融合试验显示OpaR对 pilABCD的转录具有激活作用， pilA的表达水平随培养时间的延长而持续升高；引物延伸结果显示 pilABCD只有一个转录起始位点T(-155)；EMSA和DNaseⅠ足迹试验结果显示OpaR对位于 pilA的翻译起始位点上游-246~-197 bp和-181~-131 bp之间的DNA序列具有结合活性。 结论:OpaR对 pilABCD的转录具有直接的激活活性。

目的 外泌体作为细胞信使,在体液循环中运输各种生物活性分子.本研究初步对比青年和中年男性血浆外泌体的性状特征和内含蛋白质的差异,为探索血浆外泌体内对机体有影响的蛋白质提供一定的理论指导.方法 收集青年(19.33岁±1.16岁)与中年(50.33岁±2.52岁)男性的外周血,通过差速超速离心法分离血浆外泌体,利用透射电镜、粒径分析仪和Western blot对其表征进行检测.液相质谱分析技术检测血浆外泌体蛋白,对比分析两个年龄层来源的血浆外泌体蛋白种类与功能差异.结果 青年男性血浆外泌体的平均直径和蛋白质浓度与中年男性的血浆外泌体相近,但外泌体的平均浓度略低于中年男性;青年男性血浆外泌体低表达CD9,而中年男性则呈现高表达.在两组人群的血浆外泌体中共鉴定到110个差异蛋白;相较于中年男性,青年男性血浆外泌体有36个蛋白表达上调,74个蛋白表达下调.GO功能分析显示差异蛋白的生物学过程差异主要集中在翻译延伸、细胞大分子生物合成和有机氮化合物生物合成;分子功能主要集中在翻译延伸因子、铜离子结合和核酸结合.KEGG通路分析显示差异蛋白主要富集在抗原处理、呈递和内吞作用等13条通路.在仅青年男性血浆外泌体表达的21个蛋白中,Drebrin-like protein(DBNL)同时具有神经系统和免疫系统的相关功能.结论 尽管青年和中年男性血浆外泌体在形态、粒径和浓度上无明显差异,但其表面标志物和内含蛋白质却存在显著差异.

目的:基于深度血液4D-DIA蛋白质组学分析,寻找肺腺癌骨转移组与非骨转移组的差异蛋白,为肺腺癌骨转移诊断治疗提供新线索.方法:采用4D-DIA蛋白质组学技术,纳入6例肺腺癌非骨转移(lung adenocarcinoma non-bone metastases,LUADNBM)及 6 例肺腺癌骨转移(lung adenocarcinoma bone me-tastasis,LUADBM)患者进行血清蛋白质组学分析.以表达倍数(fold change,FC)＞1.5倍(上调大于1.5倍或下调小于0.67倍)且P值＜0.05(T-test或其他)为标准,得到比较组间的上调、下调蛋白质数目.对两组间的可定量蛋白进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA).应用String网站和R语言对差异蛋白进行主成分分析(principal component analysis,PCA)、基因本体论(gene ontology,GO)分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路数据库分析.结果:LUADNBM组与LUADBM组间比较发现2 585个可定量蛋白,其中18个差异蛋白.GSEA结果显示,可定量蛋白主要富集在真核翻译延伸阶段、SARS-CoV-2主要翻译机制通路(P＜0.05).PCA结果显示,差异蛋白可明显区分LUADNBM与LUADBM患者.GO分析结果表明,差异蛋白主要富集在高尔基管腔和细胞外基质,在皮肤硫酸盐蛋白聚糖的生物合成和代谢过程以及硫酸软骨素的分解代谢和生物合成中发挥重要作用;KEGG结果表明:上调蛋白主要富集在近端小管碳酸氢盐回收、胆汁分泌、N-聚糖生物合成、胰岛素分泌、醛固酮的合成和分泌等通路;下调蛋白主要富集在神经退行性疾病的途径,如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脊髓小脑性共济失调等.结论:肺腺癌骨转移组与非骨转移组蛋白存在明显差异,通过发现新型蛋白标志物为早期筛查诊断骨转移提供新线索.

目的 探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)对水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV-1)复制的影响,以确定一个广谱抗病毒新靶点.方法 在人皮肤成纤维细胞(BJ-5ta)中转染小干扰RNA(si-eEF1A1)抑制eEF1A1表达,同时设置阴性对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Western印迹法检测转染效率,制备eEF1A1基因沉默的细胞模型.用VSV感染细胞模型,检测细胞内VSV的基因拷贝数和蛋白水平;用HSV-1感染细胞模型,检测细胞内HSV-1的mRNA水平和蛋白水平.用聚胞苷酸[poly(I:C)]或脱氧核糖核酸钠盐(HT-DNA)分别转染细胞模型,RT-qPCR检测干扰素β(IFN-β)、趋化因子10(CXCL10)和干扰素刺激基因56(ISG56)的mRNA水平,Western印迹法检测干扰素调节因子3(IRF3)和TANK结合激酶1(TBK1)蛋白磷酸化水平.结果 与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组eEF1A1的mRNA水平和蛋白水平显著降低(P<0.01),eEF1A1基因沉默的细胞模型构建成功.与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的VSV基因拷贝数下降70%～80%,VSV蛋白水平显著降低(P<0.01);HSV-1的mRNA水平下降50%～60%,HSV蛋白水平显著降低(P<0.01).poly(I:C)或HT-DNA刺激后,与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的IFN-β、ISG56和CXCL10的mRNA水平以及IRF3与TBK1的蛋白磷酸化水平无显著差异.结论 eEF1A1调控VSV和HSV-1病毒复制,提示eEF1A1对RNA病毒和DNA病毒具有潜在的广谱调控作用,且可能不通过胞内核酸识别激活的免疫通路.

[背景]苯并[a]芘(BaP)的活性代谢产物7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)可与DNA加合,但BPDE-DNA加合物图谱尚不明确.[目的]采用染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-Seq),在全基因组水平上鉴定BPDE加合位点分布及加合基因,为深入研究BaP的毒作用机制提供依据.[方法]人支气管上皮样细胞 16HBE培养至第四代达对数生长期.收获细胞并加入染色质免疫共沉淀裂解缓冲液,将裂解产物等分为实验组和对照组,实验组添加终浓度 20 μmol·L-1 的BPDE溶液,对照组添加相同体积的二甲基亚砜溶液,在 37℃环境下孵育 24 h.超声获得100～500 bp的染色质小片段.使用BPDE特异性抗体(anti-BPDE 8E11)富集与BPDE加合的DNA片段,高通量测序检测BPDE加合位点,使用MEME和DREME软件对前 1000个峰序列进行模体分析,注释BPDE在全基因组水平的加合靶基因,并通过生物信息学技术对BPDE加合靶基因进行基因本体论(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析.[结果]高通量测序共检测出 842个BPDE结合位点,在各染色体上均有分布.BPDE可以与基因编码区和非编码区共价结合,73.9%的结合位点分布在基因间区,19.6%分布在内含子区,上游 2千碱基区域、外显子区、下游 2千碱基区域及 5'非翻译区也有少量分布.对前 1000个峰序列进行分析,寻找到 4条可靠的模体,发现富含鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的位点易于结合.对结合位点进行富集,共鉴定出 199个BPDE加合靶基因,大多分布在 1号、5号、7号、12号、17号和X染色体上.GO分析显示,靶基因主要富集于核酸和蛋白质结合,参与调节催化活性、转运活性、翻译延伸因子活性,在细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递方面发挥重要作用.KEGG分析显示靶基因主要富集于心血管疾病、癌症、免疫炎症反应等相关通路.[结论]利用ChIP-Seq在全基因组水平上共鉴定出 199个BPDE加合靶基因,主要影响细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递等生物学功能,与心血管疾病、肿瘤及免疫炎症反应密切相关.

目的 基于公共数据库,分析真核翻译延伸因子1(EEF1)家族成员在肺腺癌中的作用和机制.方法 利用UCSC Xena下载癌症基因组图谱项目的人类肺腺癌转录组表达数据,并通过临床蛋白质组肿瘤分析联盟数据库下载人类肺腺癌蛋白质表达数据,通过Mann-Whitney U检验分析EEF1D、EEF1A1和EEF1A2基因和蛋白表达水平及其与临床变量间的相关性,应用Kaplan-Meier生存分析检测EEF1D、EEF1A1、EEF1A2对肺腺癌总生存期的影响.利用单样本基因集富集分析算法探讨EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达水平与肿瘤免疫细胞浸润的关系,采用Spearman和Pearson相关分析评估EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路的相关性.采用免疫组织化学方法分析肺腺癌(n=75)和癌旁组织(n=75)中EEF1D、EEF1A1、EEF1A2的表达水平.结果 EEF1D、EEF1A1、EEF1A2基因和蛋白的表达水平在肺腺癌和非癌组织间的差异均有统计学意义(P均＜0.001).EEF1A1蛋白高表达患者的总生存期预后较差(P=0.039),EEF1A2蛋白高表达患者的总生存期预后较好(P=0.012),在一些临床病理特征上,患者的EEF1D基因表达水平与总生存期的预后有关.EEF1D、EEF1A1、EEF1A2表达水平与多种免疫细胞浸润和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路中的关键基因表达显著相关.结论 EEF1D、EEF1A1、EEF1A2与肺腺癌进展相关,为肺腺癌候选的预后相关标志分子.

目的 探讨RNF113A在结直肠癌中表达的临床意义及其与免疫浸润的关系.方法 根据肿瘤基因组图谱(TCGA)通过R语言评价RNF113A在结直肠癌中的表达水平及其预后价值.通过免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western Blot等实验方法,进一步证实了这一结果.应用TCGA数据集对RNF113A进行生存分析.此外,通过基因集浓缩分析(GSEA)和免疫浸润分析检测RNF113A的功能作用.结果 RNF113A在结直肠癌样本中显著上调.RNF113A在结直肠癌中的高表达与M分期、病理分期、性别、组织学类型及肿瘤类型显著相关.RNF113A表达升高与患者预后不良密切相关,包括总生存期(OS)、无进展间期(PFI)及疾病特异性生存期(DSS).多因素Cox回归分析显示,RNF113A是影响结直肠癌预后的独立因素.受试者工作特征曲线(ROC)分析显示,RNF113A可作为结直肠癌患者的潜在诊断标志物.GSEA揭示,RNF113A可能参与多种途径,包括真核生物翻译延伸、真核生物翻译起始等.此外,RNF113A与Th2细胞、T辅助细胞、Tcm、T细胞、Th1细胞和pDC细胞的浸润水平显著相关.结论 RNF113A高表达与结直肠癌预后不良及免疫细胞浸润密切相关,可能作为判断结直肠癌预后的独立生物标志物和潜在的治疗靶点.

[目的]明确浙贝母叶斑病的致病菌种类,并筛选有效杀菌剂.[方法]采用病组织分离法,从浙贝母叶斑病病株中分离纯化真菌,以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增基因组DNA的内源转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、翻译延伸因子-1α(translation elongation factor-1α,TEF-1α)和微管蛋白基因(tubulin gene,TUB)并双向测序,经 DNAMAN 9.0软件拼接后利用基本局部对齐搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)进行分析.采用邻接法构建系统发育树以鉴定真菌种类,采用菌饼接种寄主植物和组培苗的柯赫氏法检测致病性,以生长速率法和抑菌圈法室内筛选病原真菌的有效杀菌剂.[结果]从浙贝母叶斑病病株中分离纯化获得1种间座壳属(Diaporthe)真菌.分离物的ITS、TEF-1α和TUB扩增片段与GenBank 中 Diaporthe eres(无性型为 Phomopsis oblonga,P.oblonga)相应片段的同源性分别为 100％、99.73％和 96.95％(登录号:LC342971、MW804672、MT561360).在间座壳属中,分离物与P.oblonga的亲缘关系最近.该菌株接种浙贝母植株和组培苗后诱发浙贝母叶斑病.吡唑醚菌酯、咯菌腈、异菌脲、苯醚甲环唑、腈菌唑、咪鲜胺对该真菌的半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)分别为0.174、0.084、1.092、0.041、0.619和0.004μg·mL-1;6种杀菌剂对P.obloniga孢子萌发的抑制效果为咪鲜胺＞吡唑醚菌酯＞苯醚甲环唑＞腈菌唑＞咯菌腈和异菌脲.[结论]本研究证实,P.oblonga是浙贝母叶斑病病原真菌,咪鲜胺和苯醚甲环唑是防治浙贝母叶斑病的有效杀菌剂.

真核生物翻译控制在细胞进程中对基因表达调控具有重要作用,能确保蛋白的迅速调节以维持细胞内稳态.真核翻译是一个多步骤的过程,包括起始、延伸、终止和核糖体循环,其中起始是限速步骤,受真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factors,eIFs)调控.翻译起始缺陷将导致一系列疾病.在所有eIFs中,eIF3是最大的同时知之较少的因子.eIF3A是eIF3因子的最大亚基,其异常一方面会导致肿瘤发生,另一方面将阻止肿瘤向更高级别恶性肿瘤进展.eIF3A表达变化和突变影响肿瘤患者对铂类化疗药物的反应.此外,eIF3A与纤维化病变相关,抑制eIF3A的试剂能延缓病变进展.eIF3A在肿瘤中的双重作用可能是其在肿瘤进展的不同阶段调节不同mRNAs翻译的结果,特定阶段不同mRNAs的编码产物发挥促癌或抑癌作用.