目的 探讨褐藻聚合酚(PFFE-A)对大肠癌细胞增殖与侵袭的影响,以及其对转化生长因子β1(TGF-β1)及母体抗生物皮肤生长因子同源物2/3(Smad2/3)通路的调控作用.方法 细胞分组:依次以 50、100、150 μmol·L-1的小、中、大剂量的PFFE-A干预细胞,另设立正常对照组细胞.5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)染色检测细胞的增殖;Tran-swell小室检测细胞的侵袭能力;异种种植结肠癌裸鼠模型检测细胞的体内生长与转移能力;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中上皮间质转化(EMT)相关基因的表达;Western blotting检测细胞中TGF-β1、p-Smad2/3 的表达水平.结果 与正常对照组比较,PFFE-A小、中、大剂量组细胞的增殖率、侵袭细胞数、肿瘤瘤体质量、病灶转移比例、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)的mRNA的表达、TGF-β1和p-Smad2/3 的表达明显下降(P＜0.05),E-钙黏蛋白(E-cadher-in)的mRNA的表达明显升高(P＜0.05),具有明显的剂量依赖性(P＜0.05).结论 PFFE-A能抑制肿瘤细胞的EMT过程,抑制大肠癌细胞HT29 的体外增殖与侵袭能力,下调其体内生长与转移的能力,这可能是通过下调TGF-β1/Smads信号实现的.

目的 探讨复合脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的脱细胞异种神经联合富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)修复兔面神经损伤的早期效果.方法 取 15 只 3 月龄雌性 SD 大鼠双侧坐骨神经进行脱细胞处理,作为异种神经移植体.取成年新西兰大耳白兔颈背部脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶单独消化法分离培养 ADSCs;兔耳静脉采血后经两步离心法提取 PRP;观察不同体积分数 PRP 对 ADSCs 增殖的影响,以及诱导其为类雪旺细胞可行性.取第 3 代 ADSCs,CM-Dil 活细胞染色剂标记后,荧光显微镜观察细胞标记及传代后荧光衰减情况.另取 32 只新西兰大耳白兔建立左侧面神经 1 cm 长缺损模型,随机分成 4 组(n=8),A、B、C、D组分别采用 CM-Dil-ADSCs 复合脱细胞异种神经+自体PRP、CM-Dil-ADSCs 复合脱细胞异种神经、脱细胞异种神经、自体神经移植修复神经缺损.术后 1、8 周静态下测量各组动物左侧上唇与面正中线成角(θ 角);4、8 周神经电生理检测记录神经传导速度;8 周荧光显微镜观察 A、B 组再生神经远近端 CM-Dil-ADSCs 数量,各组再生神经甲苯胺蓝染色计数有髓神经纤维、透射电镜观察再生神经纤维结构.结果 5％～20％ PRP 均能促进 ADSCs 增殖,经 20％ PRP诱导后细胞 S-100 免疫荧光染色呈阳性.ADSCs 经 CM-Dil 标记后荧光显微镜下观察示细胞标记率达90％ 以上,被标记细胞传代后细胞增殖良好,传代后荧光稍衰减.术后各组动物均存活至实验完成.术后 1 周各组动物面部均发生不同程度功能障碍,A、B、C、D 组左侧 θ 角分别为(53.4±2.5)、(54.0±2.6)、(53.7±2.4)、(53.0±2.1)°,均显著低于健侧(P<0.05);术后 8 周分别为(61.9±4.7)、(56.8±4.2)、(54.6±3.8)、(63.8±5.8)°,与健侧及术后 1 周比较差异均有统计学意义(P<0.05).大体观察各组动物再生神经完整性及连续性均良好.术后 4、8 周神经电生理检测示,A、D 组神经传导速度均显著快于 B、C 组,B 组快于 C 组(P<0.05),A、D 组间比较差异无统计学意义(P>0.05).术后 8 周荧光显微镜观察示,A 组移植神经远、近端横断面均可见大量 CM-Dil-ADSCs通过,B 组通过细胞相对较少.甲苯胺蓝染色示,A、D 组有髓神经纤维密度均显著高于 B、C 组,B 组高于 C 组(P<0.05);A、D 组间差异无统计学意义(P>0.05).透射电镜观察示,D 组有髓神经纤维鞘直径大、壁厚,形态规则;A 组髓鞘形态与 D 组相似;B、C 组髓鞘形态不规则,直径小、壁薄.结论 ADSCs 可以作为种子细胞在体内存活,并可在 PRP 诱导下分化为类雪旺细胞,与脱细胞异种神经复合后修复兔周围神经损伤可获得较好效果.

目的 探讨化学联合冻融方式处理的脱细胞异种神经支架复合体外培养的同种异体类雪旺细胞后修复面神经损伤的实验效果.方法 取日本大耳白兔腹股沟脂肪垫,通过单酶消化法体外培养脂肪间充质干细胞(adiopose-deribed stem cell,ADSCs),并通过化学试剂及自体富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)体外定向诱导成类雪旺细胞(schwann cell-like cell lineages,SCs-like);取Wistar大鼠双侧坐骨神经,通过化学联合冻融的方式制备脱细胞异种神经支架.使用DiOC16(3)荧光探针进行类雪旺细胞的标记.建立兔面神经5 mm的缺损模型,以不同移植物确立3组实验分组(n=10):A组(自体神经修复组);B组(复合DiOC16-SCs的异种神经支架修复组);C组(单纯异种神经支架修复组).术后8周通过再生神经的电生理、有髓神经纤维密度及特异性蛋白定量评价神经功能的早期修复效果.结果 术后各组动物分笼饲养,均存活良好.解剖时发现各组动物再生神经连续性及完整性均良好,未形成明显的神经瘤.术后8周各组术侧动作电位潜伏期延长,A、B组明显快于C组,且A组与B、C组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色计算再生有髓神经纤维密度,A、B组明显高于C组(P＜0.05),A、B组之间比较差异无统计学意义.再生神经内特异性蛋白神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)染色观察,可见A、B组内NGF及BDNF的蛋白含量均高于C组(P＜0.05),且A组NGF蛋白含量最高,B组BDNF蛋白含量最高.结论 复合体外定向诱导的类雪旺细胞的脱细胞异种神经支架在修复面神经5 mm的缺损中早期获得的修复效果与自体神经的修复效果相近.

目的:通过观察S100β基因修饰的SD乳鼠嗅鞘细胞(OECs)在脱细胞异种神经桥接体(ANX)的黏附情况及分泌功能,研究S100β修饰的OECs与ANX共培养体系的生物学特性.方法:用表达S100β的重组慢病毒感染SD乳鼠的OECs(S100β-OECs),利用流式细胞术检测细胞的感染效率;将感染成功的细胞注入通过化学萃取法制作的ANX内,通过扫描电镜及免疫荧光染色法观察各组OECs的黏附情况及分泌功能.结果:GFP-OECs及S100β-OECs的感染效率分别为(73.10±2.69)％和(73.50±4.59)％;通过扫描电镜观察到ANX内原有细胞主要结构基本完全去除,仅保留了细胞的的基膜结构,GFP-OECs及S100β-OECs在ANX内沿基膜纵轴方向聚集生长;免疫荧光染色结果发现,生长在ANX上的OECs、GFP-OECs、S100β-OECs均表达NGF、BDNF等神经营养因子,且S100β-OECs组S100β蛋白表达高于其他两组(P＜0.05).结论:S100β-OECs可稳定的过表达S100β蛋白,在S100β-OECs与ANX共培养体系中,S100β-OECs与ANX的生物相容性良好.

目的:观察猪脱细胞角膜基质进行人板层角膜移植术后角膜植片上皮化的临床过程.方法:收集2017年1月至2018年1月在佛山市第二人民医院经药物治疗无效的感染性角膜炎患者5例.采用脱细胞角膜基质(商品名:艾欣瞳)行板层移植术,以对侧眼为对照.术后3d,7d,1个月,3个月,6个月对患者进行随访,在裂隙灯显微镜下观察移植后植片上皮化完成过程.术后1,3,6个月共聚焦显微镜观察植片上角膜上皮细胞密度及上皮下神经纤维修复情况.结果:脱细胞角膜基质板层角膜移植术后3d开始出现上皮化,术后10d上皮化逐步完成,但角膜上皮排列疏松,荧光素染色仍有点状染色.激光扫描共聚焦显微镜检查结果显示:术后1,3,6个月角膜上皮细胞排列规则、紧密,与对侧眼比较角膜上皮细胞密度差异无统计学意义(P＞0.05).结论:应用脱细胞角膜基质行板层角膜移植术后植片上皮化过程能够顺利完成.

嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(CAR-T细胞免疫治疗)是近年来迅速崛起的一种新型的抗肿瘤疗法,因在某些适应证具有显著的临床疗效,该方法已经从实验室研究进入临床应用阶段.虽然CAR-T细胞产品设计不断更新换代,但其不良反应仍然是导致临床治疗失败的关键因素.临床试验表明细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性、B细胞发育不全、影响局部微环境的脱靶毒性是CAR-T细胞主要的不良反应.2017年国家食品药品监督管理总局颁布的《细胞治疗用产品的研究与评价技术指导原则》(试行)中指出,传统的非临床研究评价方法并不完全适用于细胞治疗产品.目前构建的肿瘤模型如常用的免疫缺陷动物模型评价CAR-T细胞毒性也存在一定的局限性,如发生特有的异种移植物抗宿主病(xGVHD)、缺少免疫系统毒性评价以及给药途径影响评价结果等.因此,深入了解和开发可以提高CAR-T细胞毒性预测能力的非临床研究方法对CAR-T细胞产品临床转化应用具有重要意义.

目的:研究脱细胞异种神经桥接体(ANX)联合经血源性间充质干细胞(MenSCs)对大鼠坐骨神经缺损的影响.方法:将SD大鼠随机分为自体移植组、单纯ANX组和ANX+ MenSCs共培养组,制备SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型,将不同组的桥接体移植到SD大鼠右侧坐骨神经缺损处,移植术后8周,用热板实验检测大鼠感觉功能的恢复,斜坡实验来检测运动功能的恢复,通过坐骨神经功能指数(SFI)检测大鼠坐骨神经功能,通过胫骨前肌湿重比率检测神经肌肉的功能,用透射电镜来观察髓鞘的恢复情况.结果:扫描电镜显示ANX组内原有的细胞及结构基本去除,完整保留了神经的基膜及外膜,ANX+ MenSCs组可见圆形的细胞在基膜间稳定黏附生长;免疫荧光染色显示神经生长因子(NGF)在ANX+ MenSCs共培养组中有阳性表达;移植术后8周,ANX+ MenSCs组的患肢回缩时间显著短于单纯ANX组(P＜0.05),爬坡坡度、SFI值以及胫骨前肌湿重比率均显著高于单纯ANX组(P＜0.05),ANX+ MenSCs组与自体组相比,两组的患肢回缩时间、爬坡坡度以及胫骨前肌湿重比均无显著差异(P＞0.05),但自体组的SFI值显著增高(P＜0.05);透射电镜显示与单纯ANX组相比,ANX+ MenSCs组和自体组的髓鞘结构更完整,虽有水肿,但形状小而均匀致密.结论:ANX联合MenSCs修复SD大鼠坐骨神经缺损的效果良好,MenSCs可能成为外周神经系统疾病细胞治疗的潜在候选种子细胞.

目的:制备低免疫原性异种脱细胞神经基质并评估其理化性能.方法:以α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO)猪坐骨神经为实验原料对基因敲除猪坐骨神经进行脱细胞处理制备低免疫原性异种脱细胞神经基质,通过HE、DAPI染色及DNA残留量检测评价神经组织的脱细胞效果;I型胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白免疫组织化学及天狼猩红染色评价脱细胞神经细胞外基质组分保留情况;α-1,3-半乳糖基(a-gal)免疫荧光检测异种抗原a-gal的残留;扫描电镜(SEM)分析脱细胞神经三维组织结构及孔隙率.结果:组织染色显示脱细胞神经基质内膜、外膜、束膜中的细胞均去除干净,DNA定量结果显示DNA含量下降了95％.天狼猩红染色及免疫组织化学结果显示脱细胞神经组织较好地保留了胶原纤维与细胞外基质主要蛋白.SEM结果显示脱细胞神经较好地保留了其三维组织结构,细胞毒性检测表明脱细胞神经基质无细胞毒性.结论:本研究自主设计的四联脱细胞方案能彻底去除神经组织中的细胞成分与异种抗原,并且较完整地保留了神经组织结构,与天然神经具有高度相似性.

背景 与目的多巴胺及多巴胺受体D1(dopamine receptor D1,DRD1)是多巴胺受体家族成员之一,在癌症进展中发挥了重要作用,但多巴胺在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的分泌水平及DRD1对HCC的影响目前尚不清楚.本研究探讨了多巴胺系统对HCC的作用,研究了DRD1与HCC患者预后的相关性.方法 采用酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测多巴胺代谢系统.采用微阵列分析、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)及实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测DRD1的表达.构建了DRD1稳定敲除和过表达的细胞系.采用Transwell、克隆形成实验和细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit 8,CCK8)法检测癌细胞的恶性表型.Western blot检测cAMP/PI3K/AKT/cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding,CREB)信号通路.有研究证实了这一信号通路在纹状体神经元中被DRD1激活并参与了肿瘤进展.建立HCC异种移植瘤用于体内实验.结果 多巴胺脱羧酶(dopa decarboxylase,DDC)水平升高及单胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAOA)水平下降引起多巴胺代谢失衡,导致HCC局部多巴胺分泌增加.多巴胺促进了HCC细胞的增殖和转移.在HCC组织中DRD1表达水平升高,DRD1表达阳性与HCC患者预后差相关.DRD1的表达上调通过调节cAMP/PI3K/AKT/CREB通路,激活HCC增殖和转移的恶性表型,而DRD1下调则发挥相反作用.阻断DRD1逆转了多巴胺对HCC的作用.DRD1选择性拮抗剂SCH23390在体内和体外实验中均抑制了HCC细胞的增殖和转移.结论 在HCC局部多巴胺分泌增加,并促进了HCC细胞的增殖和转移.DRD1对HCC进展起到促进作用,并在多巴胺系统中发挥关键作用,可作为HCC潜在的治疗靶点和预后分子标志物.

胶质母细胞瘤是一种致命的癌症,至今为止还没有有效的治疗方法.因此迫切需要更好地了解和确定选择性靶点.最近,研究人员发现,在其测试的所有胶质母细胞瘤中,包括胶质母细胞瘤干细胞/启动细胞中,细胞骨架调节蛋白( advillin,AVIL)都过度表达,但该蛋白在非肿瘤星形细胞、神经干细胞或正常脑中几乎检测不到.AVIL表达增加的胶质瘤患者预后较差.沉默AVIL几乎能根除培养物中的胶质母细胞瘤细胞,并显著抑制小鼠体内异种移植,但对正常对照细胞没有影响.相反,过表达AVIL促进了细胞的增殖和迁移,使成纤维细胞摆脱了接触抑制,并转化了永生的星形细胞,这支持AVIL蛋白可能是一个真正的癌基因.