目的:探究清除Vγ4T细胞在小鼠皮肤紫外线损伤后表皮组织修复中的作用及其机制。方法:该研究为实验研究。将54只6~8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠按照随机数字表法分为Vγ4T细胞清除组和对照组（每组27只），分别腹腔注射亚美尼亚仓鼠抗小鼠Vγ4T细胞受体（TCR）单克隆抗体200 μg、等量同型对照IgG抗体。注射后1周（之后均在此时间点取小鼠），每组取3只小鼠（之后均从这2组另取小鼠），从背部皮肤组织和腋窝、腹股沟淋巴结中分别提取真皮细胞和淋巴结细胞，行流式细胞术检测真皮细胞和淋巴结细胞中Vγ4T细胞比例；每组取5只小鼠，观察背部皮肤情况，之后行苏木精-伊红（HE）染色观察皮肤组织结构并测量表皮组织厚度；每组取5只小鼠，提取表皮细胞后行流式细胞术检测表皮细胞中树突状表皮T细胞（DETC）比例。每组取3只小鼠，分别设为Vγ4T细胞清除+5次紫外线辐射（UVR）组和对照+5次UVR组，每日1次共行5次UVR，每日照射后即刻观察背部皮肤情况；每组取5只小鼠，分别设为Vγ4T细胞清除+1次UVR组和对照+1次UVR组，均行1次UVR后即刻行HE染色后测量表皮组织厚度。每组取3只小鼠，分别设为单纯Vγ4T细胞清除组、单纯对照组；再另取3只小鼠，分别设为Vγ4T细胞清除+1次UVR组和对照+1次UVR组；均同前处理后，采用实时荧光定量反转录PCR法检测表皮组织中胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、角质形成细胞生长因子（KGF）、Vγ5TCR、白细胞介素15（IL-15）、IL-1β、IL-23、自然杀伤细胞2族成员D（NKG2D）、组织相容性抗原60（H60）、小鼠UL16结合蛋白样转录子1（Mult1）、维甲酸早期诱导蛋白1（Rae1）的mRNA表达。结果:注射后1周，Vγ4T细胞清除组小鼠真皮细胞、淋巴结细胞中Vγ4T细胞比例均明显低于对照组（ t值分别为27.99、13.12， P<0.05）；Vγ4T细胞清除组和对照组小鼠皮肤大体情况和组织结构无明显区别，表皮组织厚度相近（ P>0.05）；Vγ4T细胞清除组小鼠表皮细胞中DETC比例为（3.9±0.8）%，明显高于对照组的（1.6±0.5）%（ t=4.84， P<0.05）。与对照+5次UVR组相比，Vγ4T细胞清除+5次UVR组小鼠进行1次UVR后皮肤鳞屑增多，照射2次出现鳞屑样痂皮，照射3~5次鳞屑样痂皮明显增多。行UVR后即刻，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织厚度较对照+1次UVR组明显增加（ t=11.50， P<0.05）。与单纯对照组相比，单纯Vγ4T细胞清除组小鼠表皮组织中Vγ5TCR的mRNA表达明显上调（ t=41.16， P<0.05），IL-23的mRNA表达明显下调（ t=6.52， P<0.05）；与单纯对照组相比，对照+1次UVR组小鼠表皮组织中Vγ5TCR、KGF的mRNA表达均明显上调（ t值分别为15.22、13.22， P<0.05），IGF-Ⅰ、IL-23的mRNA表达均明显下调（ t值分别为3.71、4.95， P<0.05）；与单纯Vγ4T细胞清除组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中IGF-Ⅰ、KGF的mRNA表达均明显上调（ t值分别为11.40、18.88， P<0.05），IL-1β的mRNA表达明显下调（ t=4.42， P<0.05）；与对照+1次UVR组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中Vγ5TCR、IGF-Ⅰ、KGF的mRNA表达均明显上调（ t值分别为4.52、15.24、9.43， P<0.05）；4组小鼠表皮组织中IL-15的mRNA表达总体相近（ P>0.05）。与单纯对照组相比，单纯Vγ4T细胞清除组表皮组织中NKG2D、Rae1的mRNA表达均明显上调（ t值分别为3.67、47.40， P<0.05），对照+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显上调（ t值分别为5.30、6.50、9.16， P<0.05）；与单纯Vγ4T细胞清除组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、H60、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显下调（ t值分别为4.57、4.13、4.67、27.36， P<0.05）；与对照+1次UVR组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、H60、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显下调（ t值分别为5.77、8.18、12.90、8.08， P<0.05）。 结论:清除Vγ4T细胞有利于DETC增殖和毒性下调，可能促进UVR后小鼠表皮损伤修复 。

目的:探讨miR-20a/106b在儿童脑干胶质瘤(BSG)恶性进展中的作用及其机制。方法:回顾性纳入2012年1月至2017年12月天津市环湖医院(天津市脑系科中心医院)神经外科接受手术切除的13例儿童BSG患者和5例成人BSG患者。采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织标本中自然杀伤细胞2家族成员D(NKG2D)配体MICA的表达情况，采用生物信息学方法筛选出调控MICA的miRNA。应用人脑胶质瘤LN229和U251细胞株通过荧光素酶报告基因方法验证筛选出的miRNA与MICA的靶向调控关系，通过蛋白质免疫印迹(WB)实验检测miR-20a/106b转染LN229和U251细胞株后MICA的表达情况，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫细胞对LN229细胞株的毒性能力。通过向去胸腺幼年(3周龄)和成年(10周龄)雄性SD大鼠脑桥区立体定向注射LN229细胞株的方法制备BSG幼鼠(J-rat)和成年鼠(A-rat)模型，并根据注射细胞株不同各分为3组，依次为J-rat组、J-rat-scr组、J-rat-miR-20a/106b-d组和A-rat组、A-rat-scr组、A-rat-miR-20a/106b-u组(每组各3只)，通过免疫组织化学染色方法检测MICA的表达情况，采用MCID软件检测肿瘤的侵袭性，采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果:成人患者的MICA总阳性表达率较儿童患者高(分别为5/5、10/13， P<0.05)。检索结果显示，有23个可能调控MICA的microRNA，其中包括miR-20a和miR-106b。在LN229细胞株中，荧光素酶报告基因结果显示，转染pGL3-MICA-wt(野生型)质粒的荧光强度较对照组和转染pGL3-MICA-mut(突变型)质粒的强(均 P<0.05)；WB结果显示，与空白对照组和无义序列组比较，AS-miR-20a组、AS-miR-106b组及AS-miR-20a/106b组MICA的表达均增加(均 P<0.05)。上述实验在U251细胞株得到相似的结果。不同效靶比(20 ∶1，10 ∶1，5 ∶1)情况下，AS-miR-20a/106b组LDH的活性高于对照组和AS-miR-20a/106b＋ MICA mAb组(均 P<0.05)，但后两组的差异无统计学意义(均 P>0.05)。术后头颅MRI结果显示，3组幼鼠和3组成年鼠均成功制备脑干胶质瘤模型。MCID软件检测结果显示，J-rat-miR-20a/106b-d组 I值较J-rat组、J-rat-scr组均降低(均 P<0.05)；A-rat-miR-20a/106b-u组 I值较A-rat组、A-rat-scr组均增加(均 P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示，J-rat-miR-20a/106b-d组的MICA染色强度均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均 P<0.05)，A-rat-miR-20a/106b-u组MICA的染色强度均较A-rat组和A-rat-scr组降低(均 P<0.05)。体内凋亡实验显示，J-rat-miR-20a/106b-d组的细胞凋亡指数均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均 P<0.05)，A-rat-miR-20a/106b-u组的细胞凋亡指数较A-rat组和A-rat-scr组均降低(均 P<0.05)。 结论:miR-20a/106b通过NKG2D途经达到的免疫逃逸是导致儿童型BSG恶性度高的重要原因。

目的:探讨MYCN对NK细胞的调控作用及其介导神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）细胞免疫逃逸机制。方法:采用荧光原位杂交法（FISH）法和免疫组织化学法检测NB组织MYCN的表达情况，流式细胞术检测外周血NK细胞数量及比例、NK细胞的活化、NK细胞表面活化受体和NB细胞表面相应配体的表达状况；干扰/过表达NB细胞系MYCN，与分选的健康儿童NK细胞进行共培养，ELISA法检测共培养上清中细胞因子的分泌状况，4 h乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测NK细胞对NB细胞的杀伤性。结果:MYCN高表达NB患儿外周血NK细胞数量（ F = 45. 53， P = 0. 0002）及比例（ F = 43. 93， P = 0. 0003）显著减少，MYCN可显著抑制γ-干扰素、颗粒酶B和穿孔素的释放[SK-N-BE （2）： t = 9. 10， P = 0. 0008； t = 4. 76， P = 0. 0089； t = 4. 66， P = 0. 0096；SH-SY-5Y： t = 16. 79， P < 0. 0001； t = 35. 85， P < 0. 0001； t = 24. 66， P < 0. 0001]，抑制NK细胞的活化和对靶细胞的杀伤作用[SK-N-BE（2）： t = 7. 25， P = 0. 0019；SH-SY-5Y： t = 33. 07， P < 0. 0001]，MYCN高表达促进NK细胞NKG2A的表达[SK-N-BE（2）： t = 9. 25， P = 0. 0008；SH-SY-5Y： t = 14. 65， P = 0. 0001]，抑制NKG2D的表达[SK-N-BE（2）： t = 7. 21， P = 0. 0020；SH-SY-5Y： t = 8. 66， P = 0. 0010]，同时抑制NB细胞中NKG2D配体MICA[SK-N-BE（2）： t = 18. 35， P < 0. 0001；SH-SY-5Y： t = 56. 90， P < 0. 0001]和MICB[SK-N-BE（2）： t = 22. 40， P < 0. 0001]的表达。 结论:NB中高表达的MYCN可通过抑制NK细胞的数量及活性从而抑制NK细胞对NB细胞的杀伤介导NB细胞免疫逃逸。

自然杀伤细胞2族成员D(natural killer group 2 member D，NKG2D)是由NK细胞表达的一种免疫受体，可识别靶细胞表面上的人类主要组织相容性复合体Ⅰ类多肽相关序列(major histocompatibility complex Class I polypetide-related chain，MIC)A/B。NKG2D与MICA/B的相互作用，在病毒感染和癌症的免疫监视中发挥重要作用。该文通过膜结合型MICB下调、分泌型MICB增多及MICB基因多态性三部分对MICB/NKG2D信号通路在免疫逃逸中的研究进展进行综述。

探讨鸡血藤乙酸乙酯提取物(Spatholobi Caulis extract from ethyl acetate,SEA)在生理状态下对自然杀伤(natural kil-ler,NK)细胞的免疫调节作用及其潜在机制.利用C57BL/6J小鼠及NK-92细胞系为研究对象,设置空白组(NC)、给药组(SEA)的动物实验分组及0、25、50、100 μg·mL-1 SEA给药浓度的细胞实验分组.实验过程中及结束后获取小鼠体质量及免疫器官指数并进行差异分析;应用LDH法检测SEA对NK-92细胞的毒性及小鼠NK细胞对其靶细胞YAC-1的杀伤活性;应用CCK-8法检测SEA对NK-92细胞增殖的影响;应用流式细胞术检测小鼠外周血中NK细胞数目及NK细胞膜表面自然杀伤细胞2族成员A和D(natural killer group 2 member A、D,NKG2A、NKG2D)的表达;应用ELISA法检测小鼠血清中干扰素y(interferon gamma,IFN-γ)分泌的改变;应用半定量PCR法检测小鼠脾细胞中NKG2A、NKG2D、IFN-γ mRNA的表达;应用Western blot 法对磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/细胞外调节蛋白激酶 1(extracellular regulated protein ki-nases 1,ERK1)信号通路进行SEA药效机制的初步分析.实验结果证实,SEA对机体无明显毒副影响,可以显著增加小鼠体内NK细胞的数目及NK-92细胞对YAC-1的杀伤功能,可以抑制NKG2A受体表达并增强NKG2D受体表达,加强IFN-γ的分泌,加强PI3K/ERK信号通路蛋白表达.该研究结果提示,SEA具备增强NK细胞免疫识别杀伤功能,这一药效可能与增加NK细胞数目、重塑功能性受体表达稳态,调动PI3K/ERK信号通路并增强IFN-γ的分泌有关.

人自然杀伤细胞家族2成员D(NKG2D)配体包括主要组织相容性复合体Ⅰ类肽相关序列A(MICA)、MICB、UL16结合蛋白(ULBP),均定位于6号染色体上;由胞外结构域、跨膜区和胞质结构域三部分组成,在肝细胞癌等多种肿瘤细胞既能单独表达又可共同表达.其与NKG2D相互结合的亲和力从高到低依次为ULBP1、MICA、MICB,通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)等信号通路,使自然杀伤(NK)细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、颗粒酶增加,并使肝癌细胞Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)表达上调,促进靶细胞溶解.诱导肝癌细胞表达MICA、MICB、ULBP1,可显著增强NK细胞对其的敏感性,多途径发挥对肝癌细胞的细胞毒性效应.

自然杀伤(natural killer,NK)细胞是一类不同于T、B细胞的具有细胞毒作用的淋巴细胞.很多NK细胞相关的抗肿瘤免疫疗法已经应用于临床,如NK细胞过继回输、NK细胞抑制性受体抑制剂、促NK细胞因子回输、嵌合抗原受体-NK(chimeric antigen receptor-NK,CAR-NK)细胞回输等.另外,使用药物强化NK细胞抗肿瘤作用的疗法也具有很好的前景.目前存在很多关于药物促进NK细胞识别和杀伤肿瘤细胞的报道,其机制主要与药物上调自然杀伤细胞2族成员D(naturalkiller group 2 member D,NKG2D)配体、自然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors,NCR)配体、NKG2D受体等的表达及增加促NK细胞相关细胞因子的释放有关.笔者就近年基于药物治疗促进NK细胞抗肿瘤的研究进行综述,为以后的研究提供参考.

目的:观察自然杀伤细胞(NK)联合红花多糖(SPS)杀伤结肠癌细胞的协同效应并初步探讨作用机制.方法:四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测SPS对结肠癌细胞增殖的影响;钙黄绿素-AM释放法分析NK与SPS对结肠癌细胞的杀伤效率;ELISA及流式细胞术(FCM)分析TNF-α、IFN-γ 及NKp46、MICA、MICB、ULBP1的表达水平.结果:SPS对结肠癌细胞的增殖抑制率与作用时间和浓度成正比,促NK细胞增殖的最高阈值浓度为0.625 mg/ml;NK与SPS联合组的杀伤效率及TNF-α/IFN-γ 分泌显著高于NK组和SPS组(P<0.05);各实验组NK细胞的NKp46、MICA、MICB、ULBP1表达均升高(P<0.05).结论:NK细胞与SPS对体外杀伤结肠癌细胞具有协同作用,其作用机制可能与SPS调控NK细胞TNF-α、IFN-γ 分泌及活化性受体和活化性配体表达水平有关.

终末期肾病(ESRD)是肾功能发生不可逆地衰退,病情进展至疾病的终末阶段.主要组织相容性复合体Ⅰ相关分子A(MICA)、MICB是人组织相容性复合体Ⅰ类相关基因(MIC)家族的两个主要成员,有同样的跨膜蛋白结构,其基因均定位于6号染色体短臂的MHC Ⅰ类基因区,同源序列达90％以上.采用聚类分析法发现MICA、MICB在ESRD患者体内肾小管上皮细胞中高表达,其诱导的微炎反应以肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10升高为主要特征,高水平的MICA、MICB脱落入血形成可溶性的MICA(sMICA)、sMICB,与自然杀伤(NK)细胞表面的自然杀伤细胞家族2成员D(NKG2D)特异性结合,通过胞内内吞和降解抑制NK细胞活性,使微炎反应持续存在.采用高通量血液透析,避免透析通路隐匿性感染,可有效控制患者微炎反应.

目的 探讨玫瑰树碱(ellipticine,EPT)对人NK细胞杀伤非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞的作用及机制.方法 MTT法和CCK8法分别测定EPT对A549、H1299细胞和NK细胞增殖的影响.免疫荧光检测EPT对A549、H1299细胞DNA损伤影响.化学发光法测定EPT对NK细胞杀伤NSCLC细胞杀伤活性的影响.流式细胞术检测EPT对NK细胞脱颗粒CD107α表达影响,以及A549、H1299细胞表面MICA/B表达情况.结果 EPT明显抑制A549、H1299细胞的增殖且有时间和浓度依赖性(P<0.05),在24、48、72 h的IC50分别是12.06、3.76、1.65μmol·L-1和12.9、8.56、4.80μmol·L-1.EPT对NK细胞的24、48 h的IC50是112.71、72.03μmol·L-1.EPT在1、2μmol·L-1作用A549和H1299细胞24 h后,诱导DNA损伤,同时上调细胞表面MICA/B的表达(P<0.05),可明显增加NK细胞脱颗粒水平(P<0.05),增强NK细胞杀伤NSCLC细胞作用(P<0.05).结论 EPT可抑制NSCLC细胞增殖,诱导DNA损伤,上调NSCLC细胞表面配体MICA/B表达,同时增加NK细胞脱颗粒水平,促进NK细胞的识别与杀伤作用.