本研究通过建立一种水蛭特征肽质谱测定方法,对不同基原水蛭进行鉴别,为水蛭的鉴别与质量评价提供依据.将供试品进行提取及胰蛋白酶酶解,选择质荷比(m/z)601(双电荷)→630.35和m/z 601(双电荷)→743.44,m/z 475(三电荷)→588.76和m/z 475(三电荷)→662.30作为检测离子对,采用UPLC-MS/MS液质联用仪、Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),以乙腈为流动相A,以0.1％甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为30℃,进样量为2 μL.结果显示蚂蟥能检出水蛭多肽Ⅰ和水蛭多肽Ⅱ,柳叶蚂蟥只能检出水蛭多肽Ⅱ,水蛭只能检出水蛭多肽Ⅰ,故通过该质谱鉴别方法能区分蚂蟥、柳叶蚂蟥与水蛭三种不同基原.采用SIMCA-P 14.0软件对22批样品进行偏最小二乘法分析,可将不同基原水蛭归为三类.本研究所建立的方法专属性强、灵敏度高、重复性好,可用于区分不同基原的水蛭,提高其质量控制水平,为相关药品临床用药的安全性和有效性提供了参考依据.

目的:通过对蚂蟥野生亲本和人工养殖越冬亲本的繁殖研究,为蚂蟥人工规模化繁殖提供参考.方法:分别以春季收集的野生蚂蟥和人工养殖越冬蚂蟥为亲本,以壤土为基质,在室外开展人工规模化繁殖试验,统计蚂蟥亲本繁殖成活率、体质量回收率、相对产茧率、平均产茧数、卵茧规格和卵茧孵化率等指标,并分析人工养殖蚂蟥越冬密度对繁殖效率的影响.结果:野生蚂蟥有效繁殖亲本 2 644.83 kg,投放密度 5.00 kg/m2,产茧 577.50 kg,相对产茧率 21.84%,繁殖成活率 78.81%,亲本体质量回收率 42.74%,平均产茧数 2.64 枚/尾,卵茧孵化率 98.00%;人工养殖蚂蟥越冬亲本低密度(3.87 kg/m2)、中密度(4.97 kg/m2)、中高密度(6.07 kg/m2)和高密度(7.13 kg/m2)的亲本体质量回收率分别为 30.40%、28.19%、30.84%和 28.69%,繁殖成活率分别为 76.68%、74.03%、76.63%和69.05%,卵茧孵化率均≥98.00%,各密度之间亲本体质量回收率、繁殖成活率、卵茧规格和卵茧孵化率差异不显著,中高密度亲本平均产茧数(2.75 枚/尾)最高,与低密度和中密度之间差异显著(P<0.05).结论:蚂蟥人工养殖越冬亲本与野生亲本繁殖效果相近;初冬季人工繁殖蚂蟥价格较便宜,质量可靠,越冬繁殖应用前景广阔.建议人工养殖蚂蟥越冬繁殖密度控制在 6.10 kg/m2 左右,成活率和产茧效果较好.

HSP90 是广泛存在的分子伴侣,参与多种细胞行为,在生殖细胞的减数分裂过程中发挥重要作用,但尚不清楚在雌雄同体蚂蟥Whitmania pigra 性腺发育中的作用.为探究HSP90 对蚂蟥生殖细胞发育的影响,该研究对蚂蟥wpHSP90 基因进行了克隆,生物信息学分析以及表达量测定.结果表明,克隆得到的wpHSP90 全长 2 592 bp,其中开放阅读框(ORF)长为2 373 bp,编码 790 个氨基酸.预测wpHSP90 蛋白在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上有 85 个磷酸化修饰位点.结构域预测和多序列比较结果显示,wpHSP90 含有 HSP90 的 2 个保守结构域,与水蛭 Helobdella robusta 的同源性最高,序列相似度为80.72%.RT-qPCR结果表明,在 12～28℃,5 月龄蚂蟥性腺中wpHSP90 的相对表达量与温度呈正相关,其中雌性腺中的表达量明显高于雄性腺,且与精卵巢生殖细胞发育趋势一致.综上,wpHSP90 可能参与调控蚂蟥精卵巢生殖细胞的发育,尤其卵细胞的发育.该研究可为蚂蟥性腺发育机制的进一步研究提供参考.

目的 为蚂蟥药材及饮片(烫蚂蟥)的鉴别与质量评价提供依据.方法 采用高效液相色谱(HPLC)法建立蚂蟥药材、饮片各 15 批的特征图谱.色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.01%甲酸水溶液(梯度洗脱),流速为1.0 mL/min,检测波长为 254 nm,柱温为 30℃,进样量为 5μL;质谱条件,加热电喷雾正离子模式(HESI+),鞘气流速为 60 L/min,辅助气流速为 18 L/min,喷雾电压为 2.50 kV,毛细管温度为 288℃,辅助气温度为 475℃,扫描模式为全扫描二级质谱.指认共有峰,并采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0 版)进行相似度评价.将样品的 11 个特征峰导入SIMCA 14.1 软件进行聚类分析、主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA),探讨蚂蟥药材及饮片的区分度.采用HPLC法测定指认出的 5种成分的含量.结果 蚂蟥药材及饮片的HPLC特征图谱分别确定 8 个和 10 个共有峰(7 个相同,指认出其中 5 个).药材和饮片样品的相似度均大于 0.990.聚类分析、PCA、PLS-DA分析均能将药材和饮片分别聚为一类;PLS-DA分析结果显示,色谱峰 4,7,9-11 为区分蚂蟥药材与饮片的主要差异化合物.尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、水蛭胺C羧基衍生物、水蛭胺B质量浓度分别在 0.12～12.41μg/mL,1.20～119.62μg/mL,0.92～92.08μg/mL,1.23～122.90μg/mL,1.27～126.83μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r>0.9999,n = 5);精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于 3.0%;平均加样回收率分别为 100.03%,98.37%,92.06%,93.40%,99.93%,RSD分别为 2.03%,1.94%,2.61%,1.86%,1.66%(n = 6).结论 该研究中建立的方法操作简便、快捷、结果可靠,可为蚂蟥药材及其炮制品的区分及质量评价提供参考.

目的:为保障临床用药的安全性和有效性,建立烫水蛭(蚂蟥)及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法.方法:根据烫水蛭(蚂蟥)细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因序列设计引物,筛选出烫水蛭(蚂蟥)的稳定引物区间;在区间内筛选获得烫水蛭(蚂蟥)的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,并设计烫水蛭(蚂蟥)特异性鉴别引物TSZ-F、TSZ-R;分别收集烫水蛭(蚂蟥)及其阴性样品,建立烫水蛭(蚂蟥)配方颗粒特异性PCR鉴别方法,并对PCR体系进行优化,对该方法的耐受性和适用性进行考察.结果:当退火温度为 54℃、循环数为 34 次,烫水蛭(蚂蟥)及其配方颗粒经PCR和凝胶电泳后,可在约 133 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带,伪品无条带.结论:建立的特异性PCR鉴别方法可准确鉴别烫水蛭(蚂蟥)饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒,也为可其中药配方颗粒的质量标准研究提供参考.

采用高效液相色谱法建立水蛭药材特征图谱并同时测定5种有效成分的含量,为不同基原水蛭及其混淆品的质量评价提供依据.采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)软件对特征图谱结果进行分析,结果显示,27批蚂蟥HPLC特征图谱具有8个共有峰,并通过对照品对比确认其中5个成分,分别为:尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、水蛭胺C羧基衍生物、水蛭胺B;采用SIMCA-P 14.0软件进行聚类及偏最小二乘法分析,均可将不同基原水蛭及其混淆品归为不同的四类;另外,含量测定结果显示,不同基原水蛭及其混淆品之间的含量存在一定差异,尿嘧啶、次黄嘌呤的含量均值依次为:蚂蟥＞水蛭＞柳叶蚂蟥＞菲牛蛭;黄嘌呤的含量均值依次为:蚂蟥＞水蛭＞菲牛蛭＞柳叶蚂蟥;水蛭胺C羧基衍生物的含量均值依次为:柳叶蚂蟥＞蚂蟥＞水蛭＞菲牛蛭;水蛭胺B的含量均值依次为:柳叶蚂蟥＞蚂蟥＞水蛭＞菲牛蛭.本研究所建立的方法可作为不同基原水蛭及其混淆品的质量评价方法,为水蛭药材的质量评价提供参考依据.

50 d实验期内,比较红光(610±10)nm、蓝光(450±10)nm、白光(全光谱)和自然光(full spectrum)对30日龄蚂蟥生长和内在品质的影响.结果表明:30 ～40日龄期间,蓝光对蚂蟥的促生长作用最强,红光组和白光组在50 d后表现出明显的促进蚂蟥生长的优势,红光和白光最终质量显著高于蓝光和自然光(P＜0.05);红光下蚂蟥特定生长率(SGR)、增重率、消化酶活力均高于其他各组(P＜0.05);白光下蚂蟥SOD,CAT,ALP酶活性最高,与其他各组相比有显著差异(P＜0.05);不同光质对蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、pH和抗凝血酶活性影响不显著.蚂蟥50日龄后,红光下消化酶活性最高且生长最快,白光下抗逆酶活性最高,光质对蚂蟥内在品质无显著影响.

采用组织切片和电镜技术,对蚂蟥生殖系统及生殖细胞的发生过程进行观察.结果表明:蚂蟥具有完全独立的雌雄生殖系统,11个月为1个生殖周期;精巢先于卵巢发育,当卵细胞仅为原始生殖细胞团时,精子已经初步具备了完整的形态,精细胞和卵细胞有序发育同步成熟;根据精细胞和卵细胞的发育情况,将精巢发育分为增殖期(1～3月龄)、生长期(4～5月龄)、休眠期(6～8月龄)、成熟期(9月龄)、排放期(10月龄)和退化期(11月龄)共6个时期,将卵巢的发育分为形成期(1～2月龄)、增殖期(3～4月龄)、生长期(5～8月龄)、成熟期(9月龄)、排放期(10月龄)、休止期(11月龄)共6个时期.结论:蚂蟥是“同步性雌雄同体”动物,精卵巢发育各有6个分期,精卵细胞有序发育同步成熟.

水蛭,俗名蚂蟥,主要生活在淡水中的水库、沟渠、水田、湖沼中,嗜吸人畜血液.成蛭呈扁平纺锤形,体长约2～15 cm,宽约2～15 mm,体前端稍尖,后端钝圆,全体由多数环节构成.前吸盘不显著,后吸盘较大.背部呈黑棕色,由许多黑色斑点形成5条纵线.饮用含有幼蛭的水时,水蛭进入人体常停留于气流较小的鼻咽和鼻腔顶部,也可以进入气管内,但停留于气管内的极少见[1].福建中医药大学附属厦门第三医院呼吸二科近期收治1例气管内活体水蛭,现报道如下.

目的 探讨水蛭素抗痛风作用及其机制.方法 利用次黄嘌呤复制小鼠高尿酸血症模型,尿酸钠诱导大鼠急性痛风性炎症模型,观察水蛭素对急性高尿酸血症尿酸水平及其诱导炎症的影响;利用氧嗪酸钾诱导小鼠慢性高尿酸血症模型,观察水蛭素对慢性高尿酸血症小鼠血清尿酸、尿素氮水平及血清、肝脏黄嘌呤氧化酶活性,肾脏的病理学改变、C-反应蛋白(CRP)水平及葡萄糖转运体9(GLUT9)表达的影响.结果 水蛭素可显著降低次黄嘌呤引起的高尿酸血症小鼠血清尿酸水平,显著抑制由尿酸钠引起的大鼠足跖急性肿胀;可显著降低由氧嗪酸钾引起的慢性高尿酸小鼠血清高尿酸水平,降低血清尿素氮水平,显著抑制GLUT9的表达,减轻肾脏病理学损伤.结论 水蛭素具有显著的抗高尿酸血症及抗痛风作用,其机制可能与保护肾脏作用及调节GLUT9表达有关.