目的:原代培养小鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMC），探讨低氧对PASMC增殖及经典型蛋白激酶C（cPKC）各亚型表达的影响。方法:原代培养小鼠远端PASMC，实验用4~8代传代细胞。采用免疫印迹、免疫荧光技术检测PASMC中cPKC各亚型的表达情况。将PASMC分为常氧组和低氧组，分别置于普通培养箱（5% CO 2）和低氧培养箱（3% O 2、5% CO 2）中培养。常氧和低氧培养24 h、48 h、72 h后，Brdu法检测两组细胞增殖能力变化，免疫印迹技术、流式细胞术检测PASMC中cPKC各亚型蛋白的表达变化。 结果:免疫印迹、免疫荧光技术检测显示小鼠PASMC存在cPKCα、cPKCβⅠ和cPKCβⅡ的表达，而无cPKCγ表达。免疫荧光检测显示，与常氧组相比，低氧24 h、48 h、72 h后低氧组PASMC的Brdu阳性细胞与DAPI阳性细胞比值均显著增高（均 P<0.05），其中低氧72 h时最明显。免疫印迹技术、流式细胞术检测结果显示，与常氧组比较，低氧24 h、48 h、72 h后低氧组PASMC中cPKCα、cPKCβⅠ、cPKCβⅡ蛋白表达均增高（均 P<0.05）。 结论:低氧可能通过调控cPKCα、βⅠ和βⅡ信号通路诱导小鼠远端PASMC异常增殖。

目的:探讨冠状病毒感染所致心力衰竭（心衰）的机制，并预测对其可能有效的药物。方法:在基因表达数据库（GEO）检索冠状病毒和心衰，并筛选符合实验要求的组学数据。采用R语言Limma程序包进行差异表达基因分析，筛选差异表达基因。将两组差异基因导入R语言clusterProfiler包进行基因本体学（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，取两组结果的交集。采用STRING数据库对所有差异表达基因构建蛋白质互作网络并筛选核心基因。最后采用团队自主研发的表观精准治疗预测平台EpiMed预测冠状病毒所致心衰的治疗药物。结果:在GEO数据库检索并筛选得到GSE59185冠状病毒数据集，根据不同的亚型分为wt组、?E组、?3组、?5组、对照组5组样本，差异分析发现各亚组交集上调基因191?个，下调基因18?个。在GEO数据库检索并筛选得到GSE126062心衰数据集，共筛选差异表达基因495?个，其中上调165?个，下调330?个。冠状病毒与心衰差异表达基因富集分析，取交集处理共有GO条目20条，主要富集在病毒反应、病毒防御反应、Ⅰ型干扰素反应、γ干扰素调节、先天免疫反应调节、病毒生命周期负调控、病毒基因组复制调控等；共有5条KEGG通路，主要与肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素（IL）-17信号通路、细胞因子与受体相互作用、Toll样受体信号通路、人类巨细胞病毒感染有关。蛋白互作网络分析筛选出信号传导及转录激活蛋白3、IL-10、IL-17、TNF、干扰素调节因子9、2′, 5′-寡腺苷酸合成酶1、丝裂原活化蛋白激酶3、S-腺苷甲硫氨酸基区域蛋白2、CXC趋化因子配体10、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3共10?个核心基因。EpiMed平台预测可能对冠状病毒所致心衰有效的药物为TNF-α抑制剂、白藜醇、利托那韦、白芍、维甲酸、连翘、鱼腥草等。结论:多个炎症通路的异常活化可能是冠状病毒感染所致心衰的原因，白藜芦醇、利托那韦、维甲酸、白芍、连翘、鱼腥草可能对其具有治疗作用。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作为细胞能量代谢的调控因子,有望成为肿瘤治疗的新靶点[1].AMPK是一个由α、β、γ三个亚基构成的异源三聚体蛋白,每个亚基又分别由不同基因编码的α1,α2,β1,β2,γ1-γ3亚型[2].AMPK的主要上游激酶分别是钙调激酶K(CaMKK)和抑癌激酶(LKB1),LKB1/AMPK途径在杀伤肿瘤细胞方面发挥作用,包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌等[3,5].本研究应用AMPK激动剂AICAR和AMPK抑制剂Compound C考察AMPK对入骨肉瘤细胞株MG-63凋亡的影响,探讨AMPK激活诱导骨肉瘤细胞株MG-63凋亡的机制.

目的 通过硝酸甘油致偏头痛大鼠模型,初步探讨蛋白激酶Cγ亚型(PKCγ)、N-甲基-天门冬氨酸受体1(NMDAR1)和磷酸化NMDAR1在偏头痛发病机制中的作用.方法 将30只成年雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、干预组,后两组再各自分为发作期组和间歇期组,每组6只.模型组及干预组按Tassorelli Cristina法复制偏头痛大鼠模型,对照组用生理盐水造模.干预组每天灌服氟桂利嗪2 ml(0.5 mg/kg),对照组每天灌服生理盐水2ml.受试动物于第5次造模后2h(发作期组)或第4天(对照组及间歇期组)分别断头处死取脑干组织.RT-PCR法检测PKCγ及NMDAR1 mRNA,Western-Blot检测PKCγ、NMDAR1、磷酸化NMDAR1蛋白的表达.结果 与对照组相比,无论是偏头痛发作期组和间歇期组,还是模型组和干预组大鼠脑干组织中PKCγ、NMDAR1 mRNA及蛋白的表达差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,模型组PKCγ依赖的磷酸化NMDAR1蛋白的表达明显上调(P＜0.05);干预组也稍有上调,但差异无统计学意义(P＞0.05).模型组与干预组,以及发作期与间歇期相比,磷酸化NMDAR1蛋白的表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 偏头痛的发生发展可能与PKCγ依赖的磷酸化NMDAR1蛋白表达的上调有关,可能与PKCγ mRNA及蛋白、NMDAR1 mRNA及蛋白(非磷酸化)的表达量无关.氟桂利嗪预防偏头痛发作的机制之一可能是打断了PKC-NMDAR这一正反馈环路的恶性循环.

目的:探讨脂多糖(LPS)联合z-VAD-FMK介导M1亚型巨噬细胞程序性坏死的机制.方法:使用佛波酯(PMA)和干扰素γ(IFN-γ)诱导THP-1细胞系分化得到M0和M1亚型巨噬细胞.以LPS(100μg/L)分别处理M0和M1巨噬细胞,检测不同时点的乳酸脱氢酶释放和DNA断裂情况,并观察不同抑制剂的影响.采用Western blot法检测受体相互作用蛋白(RIP)1、RIP3、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38和NOD样受体蛋白3(NLRP3)的蛋白水平.结果:LPS能够诱导M1亚型巨噬细胞发生死亡,联合z-VAD-FMK可特异性介导M1亚型巨噬细胞发生程序性坏死,而对M0亚型巨噬细胞无此作用.IFN-γ能够上调RIP3表达,并增强LPS介导的JNK磷酸化,RIP3和JNK抑制剂可部分阻断LPS联合z-VAD-FMK介导的M1亚型巨噬细胞程序性坏死.结论:IFN-γ上调RIP3和增强LPS介导的JNK磷酸化,使得LPS联合z-VAD-FMK能特异性诱导经过IFN-γ预处理的巨噬细胞发生程序性坏死.

目的 探讨机体感受和调制痛觉的最高级中枢初级躯体感觉区(S1区)神经元特异性蛋白激酶C γ亚型(protein kinase C γ isoform,PKCγ)在重要功能结构脂筏上转位水平的变化与瑞芬太尼诱导痛觉过敏的联系. 方法 8～10周龄SD大鼠50只,按照随机数字表法分为丙泊酚组(P组,20只)、瑞芬太尼组(R组,20只)和对照组(C组,10只),P组和R组经尾静脉予相应麻醉,C组不予任何措施.P组、R组各取10只大鼠,分别于麻醉前及麻醉停药后0.5、2、5、24 h测定大鼠机械刺激缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT).P组、R组剩余大鼠(各10只)及C组10只大鼠分别于停药后2 h(7只)、停药后24 h(3只)断头处死,分离S1区,Western blot测定全细胞及脂筏PKCγ水平. 结果 ①R组大鼠PWMT在停止输注后2h明显低于P组(P＜0.05).②停药后2h,2组动物S1区全细胞PKCγ水平差异无统计学意义(P＞0.05);R组动物脂筏PKCγ水平明显高于P组(P＜0.05). 结论 S1区PKCγ脂筏转位增加,证实了瑞芬太尼停药后S1区神经细胞活化.可能是瑞芬太尼诱导痛觉过敏的机制之一,或是瑞芬太尼诱导痛觉过敏后带来的细胞内信号改变.

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一组包括细胞外信号调节激酶1/2、c-Jun氨基端激酶1/2/3、p38亚型(α,β,γ和δ)和细胞外信号调节激酶5的丝/苏氨酸蛋白激酶,能够介导增殖、分化、凋亡、免疫、炎症等一系列细胞活动.痛觉敏化是一种中枢和外周伤害性感受器的重塑机制.大量研究显示,MAPKs在糖尿病动物模型的脊髓和背根神经节中广泛激活,在糖尿病神经病理性疼痛(DNP)中枢敏化和外周敏化中发挥了重要的作用.此外,一些药物也可通过抑制中枢和外周神经系统中MAPKs的激活来缓解DNP.本文主要总结了MAPKs在DNP中枢和外周敏化中作用的研究进展.

目的:观察低氧及低氧复合运动对骨骼肌内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及线粒体生物合成的影响,并探讨相关分子机制.方法:雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为常氧对照组(NC组)、低氧对照组(HC组)和低氧复合运动组(HT组).低氧干预为常压低氧帐篷,11.3％氧浓度持续暴露6周.运动干预为跑台训练(5°,15 m/min),60 min/d,6 d/周,共6周.低氧暴露结束后即刻处死大鼠,取双下肢股四头肌.紫外分光光度法检测股四头肌羰基化蛋白含量和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性,荧光定量PCR法检测微小RNA-208b(miR-208b)表达,Western-blot法检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)总蛋白及磷酸化水平、真核起始因子2α(eIF2α)总蛋白及磷酸化水平、线粒体生物合成相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)和细胞色素c氧化酶Ⅳ亚型(COXⅣ)蛋白表达.结果:与NC组比较,HC组骨骼肌羰基化蛋白含量、GRP78、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α表达显著升高(P<0.01),GST活性、miR-208b、PGC-1α和COXⅣ表达显著降低(P<0.05～0.01).与HC组比较,HT组骨骼肌羰基化蛋白含量、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α表达显著降低(P<0.01),GST活性、miR-208b、PGC-1α和COXⅣ表达显著升高(P<0.01).结论:低氧复合运动通过上调抗氧化酶抑制低氧活化的ERS,进而通过miR-208b-PGC-1α通路上调骨骼肌线粒体生物合成,提高低氧耐受性.

目的 使用网络药理学的研究方法对真武汤治疗慢性心力衰竭的作用机制进行研究探讨.方法 在中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)筛选真武汤的活性化合物成分,运用Perl编程语言以及通用蛋白(Universal Protein,uniprot)数据库得到真武汤的基因靶点;在GeneCards数据库检索和筛选慢性心力衰竭相关疾病基因靶点进行检索,使用R语言筛选出共同的靶点并构建韦恩图;应用Cytoscape 3.7.1软件构建“活性成分-靶点”网络图;将共同靶点输入功能蛋白关联网络STRING数据库,获得蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络模型;使用R语言对“活性成分-靶点”相互作用网络图中的核心靶点基因进行基因本体论(gene ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析.结果 预测得到真武汤活性化合物成分中51种以及潜在靶点381个;得到慢性心力衰竭疾病相关靶点980个,得到真武汤-慢性心力衰竭共同靶点20个,度值较高的活性成分包括β-谷甾醇(β-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、石防风素(deltoin)等,度值较高的靶点蛋白包括前列腺素内过氧化合物合酶(PTGS1)、核受体亚家族3组C成员2(NR3C2)、毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型3(CHRM3)、乙酰胆碱酯酶(ACHE)等;PPI网络中的核心基因包括白细胞介素-6(IL-6)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶-8(MAPK8)、细胞间黏附分子-1(ICAM1)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)等;共同作用靶点主要富集于21种生物功能与61条信号通路上.结论 通过运用网络药理学的研究方法我们发现真武汤治疗慢性心力衰竭具有多靶点、多通路的特点,从抑制炎症反应、调节免疫功能及调控细胞凋亡等多个机制治疗慢性心力衰竭.

本文旨在探讨不同时长、不同强度运动对大鼠骨骼肌线粒体功能和自噬的影响及FUNDC1的作用.选取60只雄性SD大鼠随机分为2周、4周的安静对照组(Con组)、中等强度运动组(M-ex组,跑台运动16 m/min,1 h/d,6 d/week)和大强度运动组(Hi-ex组,跑台运动35 m/min,20 min/d,6 d/week),每组10只.干预结束后分离双侧比目鱼肌,石蜡切片制备透射电镜样本,用ELISA检测柠檬酸合成酶(citrate synthase,CS)的含量,用冰冻切片免疫荧光染色法观察微管相关蛋白1轻链3(micro-tubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)/细胞色素c氧化酶Ⅳ亚型(cytochrome c oxidase Ⅳ, COX-Ⅳ)、FUNDC 1/COX-Ⅳ及LC3/FUNDC1的共定位情况.提取骨骼肌线粒体,用Westem blot检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α (peroxisome proliferator-activated receptor γco-activator-1α,PGC-1α)、COX-Ⅰ、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α,AMPKα)、p-AMPKα、Unc-51样激酶1(Unc-51 like kinase 1,ULK1)、FUNDC1、LC3、自噬选择性底物(p62)等自噬相关蛋白表达.结果 显示,运动可上调线粒体功能,即PGC-1α、COX-Ⅰ蛋白表达和CS含量,2周Hi-ex组和2周M-ex组之间无差异,而4周Hi-ex组显著低于4周M-ex组.在运动强度相同的情况下,4周运动组大鼠的骨骼肌线粒体自噬激活程度高于2周运动组;在运动时长相同的情况下,Hi-ex组的线粒体自噬激活程度高于M-ex组.2和4周运动干预均可提高LC3/COX-Ⅳ、COX-Ⅳ/FUNDC1、FUNDC1/LC3共定位.运动可提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,下调p62蛋白表达水平,上调FUNDC1、ULK1蛋白表达水平和AMPKα磷酸化水平,4周Hi-ex组的这些蛋白表达变化幅度显著大于4周M-ex组.以上结果提示,运动可诱导骨骼肌线粒体自噬,自噬的激活程度与运动时间和强度有关,运动的诱导机制可能是通过AMPK-ULK1通路影响FUNDC1的表达.