目的:探讨m.4435A>G和YARS2 c.572G>T(p.G191V)突变在原发性高血压发生发展中的作用.方法:分析前期收集的高血压患者的线粒体基因组及外显子测序数据,对一例携带m.4435A>G和YARS2 p.G191V突变的原发性高血压患者的家系开展临床资料采集及分子遗传学检测,收集外周静脉血并构建永生化淋巴细胞系进行线粒体转移RNA(tRNA)、线粒体蛋白质、腺苷三磷酸(ATP)、线粒体膜电位(MMP)和细胞内活性氧检测.结果:线粒体全基因组测序结果显示,该家系中母系成员均携带高度保守的m.4435A>G突变,该突变影响线粒体tRNA的二级结构和折叠自由能并改变其稳定性,预测其将影响反密码子环结构.与对照组比较,携带m.4435A>G和YARS2 p.G191V突变的细胞株相关线粒体tRNA稳态水平、部分线粒体蛋白表达量、ATP产量和MMP水平下降,且活性氧水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论:YARS2 p.G191V突变通过影响线粒体tRNA稳态水平加重了m.4435A>G引起的线粒体翻译及线粒体功能改变,进一步导致细胞功能障碍,表明在本家系中YARS2 p.G191V与m.4435A>G突变存在协同作用,共同参与原发性高血压的发生发展.

本研究以石磺科贝类转录组数据库为基础,克隆出一条Ⅱ型非肌肉型肌球蛋白重链(NMHCⅡ)基因的全长cDNA,将其命名为Os-NMHC.该序列全长为6057bp,包括5733bp的开放阅读框,236bp的5'端非翻译区,88bp的3'端非翻译区,共编码1910个氨基酸.预测蛋白质等电点为5.26,相对分子质量为220.46 kD.通过Phyre2程序和Pymol软件构建蛋白质三级结构图,预测蛋白质二级结构以α 螺旋和β 折叠为主;通过Clustalx 和dnaMAN 软件进行氨基酸序列比对,发现其与爪蟾NMHC Ⅱ A 序列一致度为60.37％,其与爪蟾NMHC Ⅱ B 序列相似度为61.47％;通过Bayes 软件构建系统进化树,发现其与加州海兔亲缘关系最近.通过qRT-PCR 技术检测,发现该基因在四种石磺的背部、腹部、腹足部、肺囊、心脏、神经节中均有不同程度的表达.种间表达水平与进化趋势相一致,依次为:瘤背石磺≥平疣桑椹石磺>里氏拟石磺>紫色疣石磺.

目的 应用高通量测序技术分析普通棉耳狨猴粪便菌群的结构与组成,为进一步开发利用新型实验动物奠定基础.方法 采集4只成年雄性普通棉耳狨猴粪便,用细菌16S rRNA通用引物扩增V3～V4区,采用Illumina MiSeq测序平台对普通棉耳狨猴粪便微生物进行研究.结果 共测序获得315511条有效序列与596个OTU.普通棉耳狨猴粪便中的细菌共鉴定出9个门、14个纲、26个目、50个科、82个属和64个种和226个OTU.其中,1)优势门是拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),平均含量分别为54.52％ 和25.39％2)丰度最高的纲为拟杆菌纲(Bacteroidia)和厌氧菌纲(Negativicutes),平均含量为54.5％和17％.3)乳杆菌目(Lactobacillales)和拟杆菌目(Bacteroidales)的丰度最高,为50.01％和20.52％.4)普雷沃菌科(Prevotellaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)所占丰度最高,平均含量分别为43.14％和11.33％.5)双歧杆菌属(Bifidobacterium)和拟杆菌属(Bacteroides)的丰度较高,平均含量分别为11.33％11.12％.6)有益菌群双歧杆菌属丰度较高,但在所检测样本中都含有.7)丰度最高的前10个种,归类为7个科、5个纲.这10个种占到33.16％,其他53种总和仅占到0.74％,其他未鉴定出菌种,且相对丰度还较高,需要进一步研究.8)PICRUSt功能预测分析:氨基酸转运等代谢功能和蛋白质翻译、折叠遗传信息处理功能丰度较高.结论 应用高通量测序技术,较全面的检测了普通棉耳狨猴粪便菌群,普通棉耳狨猴粪便细菌组成具有丰富的多样性,其中还有许多未被分类鉴定且相对丰度较高的细菌,需要进一步研究.

目的:筛选棕榈酰化修饰水平受雄激素诱导的蛋白,探索前列腺癌去雄激素治疗外其他潜在的治疗靶点.方法:以LNCaP细胞为研究对象,雄激素(Methyltrienolone,R1881,5 nmol/L)或DMSO(dimethyl sulfoxide)处理LNCaP细胞24h,同时利用人工合成的炔基棕榈酸Alk-C16(100 μmol/L)对细胞进行代谢标记,收集细胞,裂解,提取总蛋白,加入标记有叠氮化物的琼脂糖珠(1 mmol/L),室温反应1h,利用叠氮化物与Alk-C16末端炔基发生点击化学反应形成的共价键将棕榈酰化修饰蛋白富集在琼脂糖珠上,进行蛋白质谱非标记定量分析(label-free quantitation,LFQ),比较R1881处理和非处理细胞蛋白棕榈酰化修饰变化情况,筛选棕榈酰化修饰水平受雄激素诱导的蛋白.结果:实验共鉴定出907个潜在的棕榈酰化修饰蛋白(mascot score＞2,P＜0.05),其中有430个蛋白LFQ值至少有2次不为0.在这430个蛋白中有92个蛋白R1881处理与非处理样品LFQ比值大于1.5(P＜0.05),说明雄激素能够显著促进该蛋白棕榈酰化修饰.利用Cytoscape软件对92个蛋白进行功能富集分类,发现已知功能蛋白可分为代谢相关、蛋白折叠相关和翻译起始相关3类,其中,代谢相关蛋白包括脂代谢(6个)、糖代谢(7个)和呼吸电子传递链(8个)3部分,另外还有少量氨基酸代谢(2个)和其他代谢相关蛋白(2个).参与呼吸电子传递链的细胞色素b-cl复合体亚基2(cytochrome b-cl complex subunit2,UQCRC2)雄激素R1881处理和未处理样品LFQ比值最高(＞3,P＜0.05),说明该蛋白棕榈酰化修饰受雄激素诱导最为明显.LFQ比值最高为UQCRC2,其次为脂代谢相关的长链特异性酰基辅酶A脱氢酶(very long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase,ACADVL)和糖代谢相关的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,PGD),但其LFQ比值均未超过3.结论:代谢尤其是呼吸电子传递链相关蛋白的棕榈酰化调控机制的研究可能将为前列腺癌的诊疗和靶向药的研发提供新的指导思路.

人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)又称胰淀素(Amylin),是胰岛 β 细胞中胰岛素的共分泌蛋白,与胰岛素共同包裹在囊泡中被分泌出细胞.正常生理条件下,hIAPP有助于胰岛素分泌并调节机体血糖平衡;但其蛋白错误折叠或过量积累则会对细胞造成毒性,进而影响β细胞功能,导致机体罹患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM).为了清除细胞内过度积累的hIAPP,且不影响其正常的合成功能,本研究选用一种新的蛋白质降解技术——Trim-Away,该技术可以在短时间内降解目标蛋白质,且不会对靶蛋白的mRNA转录、翻译等功能产生影响.首先在大鼠(Rattus norvegicus)胰岛素瘤细胞(insulinoma cells,INS1)中过表达hIAPP模拟其过度累积的情况,并通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的释放、CCK8(cell counting kit-8)的活性以及PI-Annexin V流式检测的阳性比例变化,证明hIAPP的过度积累造成 β 细胞的凋亡;通过实时定量PCR及ELISA检测发现胰岛素的合成和分泌都受到了阻碍;最后利用Trim-Away技术在hIAPP过表达的INS1细胞中特异性清除了过度积累的hIAPP蛋白.细胞活性实验证实清除hIAPP蛋白可以减少细胞的死亡,ELISA实验证实INS1细胞恢复了胰岛素的分泌能力.本研究验证了hIAPP过度积累对INS1细胞的毒性作用,并且证明Trim-Away技术在清除胰腺 β细胞中hIAPP毒性具有效果,为利用Trim-Away治疗糖尿病提供了新的策略.

翻译延伸是核糖体将信使RNA(mRNA)蕴含的遗传信息解码为蛋白质的有序过程,是细胞维持基本代谢活动的核心步骤.多种人类疾病(如神经退行性疾病、癌症等)都与翻译延伸的异常有关.翻译延伸作为中心法则的关键步骤曾是现代分子生物学研究的重点内容,然而方法学上的限制却阻碍了对其动态过程以及调控规律的进一步研究.近年来,对翻译延伸调控相关方法的突破让与其相关的生命科学研究获得了长足的发展,尤其是近10年来的研究揭示了翻译延伸的复杂调控机理和多种生物学效应,为理解蛋白表达调控和疾病发生的关联提供了新的理论视角.本文在总结翻译延伸研究方法的基础上,重点探讨了顺式调控元件(mRNA与新生肽链序列)对局部翻译延伸速率的调控作用,同时列举了翻译延伸调控对模板mRNA和蛋白质产物功能的影响,包括mRNA稳定性、蛋白质的合成与降解、蛋白质亚细胞定位以及蛋白质共翻译折叠等,以期吸引生命科学各领域的学者共同参与翻译延伸领域的研究.

目的 应用生物信息学方法预测分析结核潜伏感染相关蛋白Rv3407的结构及功能. 方法 从NCBI数据库中搜索结核分枝杆菌Rv3407蛋白的氨基酸序列,分别利用ProtParam、Protscale、TMHMM、PSORT、SignalP、I-TASSER、NetNGlyc、NetPhos、Motif Scan、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析蛋白质的理化性质、亲(疏)水性、跨膜螺旋、亚细胞定位、信号肽,可能与之结合的配体和该配体的结合位点、糖基化、磷酸化和翻译后修饰位点及二、三级结构;采用BepiPred、ABCpred、IEDB预测分析B细胞表位,采用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC、NetCTL预测分析细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,采用SYFPEITHI和RANKPEP预测分析辅助性T(Th)淋巴细胞表位.结果 Rv3407蛋白共由99个氨基酸构成,分子式为C471H807N155O144S2,不稳定指数为46.59,为亲水性不稳定蛋白;无跨膜螺旋区及信号肽,细胞内定位为胞浆蛋白;可能与之结合的配体有4个;无糖基化位点;苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点分别有2和4个;酰胺化、cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、N-豆蔻酰化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化的位点各1个;其二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲分别占45.45％、11.11％、8.08％及35.35％;B细胞表位可能分布于28-36、50-54、68-71、78-86、96-99位氨基酸残基或其附近;CTL表位可能分布于57-65,40-48,87-95位氨基酸残基或其附近;Th表位主要集中分布于2-39、45-63、71-85位氨基酸残基或其附近. 结论 结核潜伏感染相关蛋白Rv3407存在多个潜在的B细胞及T细胞抗原表位,其中以T细胞抗原表位占优势,免疫原性良好,可为结核潜伏感染疫苗的研制、免疫学诊断等提供理论依据.

[目的]本研究旨在结合酵母菌蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)与其底物蛋白鸡胱抑素C (chicken cystatin C,cC)在酵母中的共表达,理解PDI影响外源蛋白合成与表达的调控规律.运用转录组深度测序技术(RNA-Seq)筛选差异基因,调取并鉴定影响cC表达的关键基因,为解析外源蛋白高效表达机制,改造工程菌株提供理论支撑.[方法]以巴斯德毕赤酵母GS115、GS 115-cC为出发菌株,采用电转的方法将携带PDI编码基因的载体pPIC3.5K转入到GS 115/GS 115-cC菌株,使其在菌株中过表达,研究过表达PDI对cC表达的影响.采用RNA-Seq深度测序方法,研究重组毕赤酵母基因表达差异情况.并结合KEGG注释结果对数据进行分析,挑选差异显著表达基因进行验证,初步明确其在蛋白表达调控方面的功能.[结果]本研究通过构建过表达PDI重组毕赤酵母菌株,使得外源蛋白cC的表达量显著增加.利用RNA-seq技术分析过表达PDI菌株与正常菌株的差异,最终筛选了373个差异表达基因,其中有122个差异基因注释到KEGG生物通路,包括12个基因注释到蛋白质转运和分解代谢途径,21个基因注释到蛋白质折叠分选和降解途径,以及24个基因参与蛋白质的翻译途径等.[结论]在毕赤酵母中过表达PDI能显著增加外源蛋白cC的表达量.通过对过表达与正常表达PDI的毕赤酵母基因的表达谱分析,初步确定了其中一些转录情况变化显著的基因,明确了它们参与的细胞途径和信号通路,为改造具有高效率表达淀粉样蛋白的酵母菌株奠定基础.

鉴于遗传密码子的简并性能够将基因遗传信息的容量提升,同义密码子使用偏嗜性得以在生物体的基因组中广泛存在.虽然同义密码子之间碱基的变化并不能导致氨基酸种类的改变,在研究mRNA半衰期、编码多肽翻译效率及肽链空间构象正确折叠的准确性和翻译等这一系列过程中发现,同义密码子使用的偏嗜性在某种程度上通过精微调控翻译机制体现其遗传学功能.同义密码子指导tRNA在翻译过程中识别核糖体的速率变化是由氨基酸的特定顺序决定,并且在新生多肽链合成时,蛋白质共翻译转运机制同时调节其空间构象的正确折叠从而保证蛋白的正常生物学功能.某些同义密码子使用偏嗜性与特定蛋白结构的形成具有显著相关性,密码子使用偏嗜性一旦改变将可能导致新生多肽空间构象出现错误折叠.结合近些年来国内外在此领域的研究成果,阐述同义密码子使用偏嗜性如何发挥精微调控翻译的生物学功能与作用.

白质消融性白质脑病(leukoencephalopathy with vanishing white matter,VWM)是一种常染色体隐性遗传性脑白质病,其致病基因EIF2B1～5分别编码真核细胞蛋白质翻译起始因子2B(eukaryotic initiation factor 2B,eIF2B)的5个亚基α～ε,其中任一编码基因突变均可引起发病.起病多见于婴幼儿及儿童期,临床表型差异大,典型表现为进行性运动功能退行,可伴共济失调和癫痫.应激(发热、外伤等)可导致发作性加重.影像学显示大脑白质进行性液化.尸解神经病理学特征主要表现为广泛性白质稀疏和囊性变性,无神经胶质细胞反应性增生,星形胶质细胞形态异常,过表达祖细胞标志物巢蛋白(Nestin)和胶质纤维酸性蛋白δ(GFAPδ),少突前体细胞数量增加和成熟少突胶质细胞减少、泡沫化且凋亡增加.VWM致病基因EIF2B1～5是管家基因,但多数患者通常仅脑白质受累.少数胎儿期及婴儿早期发病的患者可出现多系统受累,成年女性患者可有卵巢功能障碍.目前认为,星形胶质细胞在其致病机制中起着核心作用,病理性星形胶质细胞继发性引起少突胶质细胞成熟障碍和髓鞘形成异常,进而导致脑白质病变.其他疾病机制包括内质网应激后未折叠蛋白反应(UPR)过度激活、线粒体功能障碍、自噬抑制等,尚不完全明确.