尽管节肢动物类(主要指昆虫纲和蛛形纲)病媒和害虫的综合治理取得了较大进展,但其对公共卫生及人类健康仍造成巨大威胁,且这种情形随着全球化、城市化和常规杀虫剂滥用以及抗药性的发展变得更加严峻.有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类常规杀虫剂在历史上对保护人类和动物免于病媒生物和其他城市害虫的侵害起着重要作用,但这些杀虫剂对环境和非靶标生物的不良影响在全球范围内也越来越受到关注.20世纪70年代以来,随着对节肢动物生物学的深入了解,基于昆虫生长调节剂的软性杀虫剂的研发受到了极大的重视.传统杀虫剂因具有易获得和见效快等优点已被使用者和公众广泛接受,软性杀虫剂的研发经历曲折.然而,基于昆虫激素类似物、模拟物或者激动剂以及几丁质合成抑制剂的软性杀虫剂在很多方面也取得了长足的进展.软性杀虫剂中发展和使用最成功的案例是保幼激素类似物(比如烯虫酯、烯虫乙酯和烯虫炔酯),已经应用于多种病媒生物和环境害虫的治理.最近,S-烯虫酸叔丁酯的诞生又带来了新的成功机遇.保幼激素模拟物吡丙醚和苯氧威因在病媒生物和其他害虫治理中具有显著的应用价值也得到了较好的研究和开发.保幼肽因其生物活性和作为多肽可以预期的环境安全性,近年来再次引起人们的关注.相比保幼激素类似物,蜕皮激素受体激动剂对靶标生物具有更宽的敏感窗口期,研发潜力巨大.几丁质合成抑制剂因其作用方式独特和杀虫谱广而备受重视.总之,不管软性杀虫剂单独使用,还是与传统杀虫剂联合使用,在不久的未来都将在病媒生物及其他城市害虫的治理方面发挥重要作用.

昆虫卵黄原蛋白(Vitellogenins,Vg)是一种多功能的生殖发育关键调控蛋白,在不同昆虫体内的结构、合成调控及功能不尽相同.随着基因编辑技术的成熟,运用分子手段调控Vg的合成,可减少卵黄发生,降低昆虫的繁殖力,成为有效防治害虫的优势方法之一.因此,Vg及其合成调控的研究受到广泛关注.半翅目害虫是农林业的重点防治对象之一,除直接刺吸为害寄主外,其常传播植物病原体,对农业生产造成了严重危害.半翅目昆虫Vg除在生殖发育中的关键作用外,还与病原菌的传播、寄主免疫等密切相关,可成为分子水平防治半翅目害虫及其继发病害的优势靶标.因此,本文总结了半翅目昆虫Vg的合成方式、合成场所,指明了其结构上蛋白亚基数目的差异,概述了其与昆虫免疫反应、植物防御、病毒传播等有关的研究进展,总结了其合成的保幼激素(包括保幼激素受体Methoprene-tolerant和转录因子Krüppel homolog 1等关键调控因子等)、蜕皮激素和胰岛素信号通路等主要的内分泌激素调控通路,以及以营养信号调控为主的非激素调控通路,为探索半翅目害虫的分子防控手段提供理论依据.

microRNA(miRNA)是一类长度约为23个核苷酸的非编码内源性小分子RNA,参与真核生物基因表达的调控,从而在生物发育和应对环境中起着重要的作用.为了探讨novel miRNA在害虫发育中的作用,本研究对斜纹夜蛾Spodoptera litura miRNA数据库中表达量较高的novel-m0287-3p进行了研究.通过生物信息学分析,确定了novel-m0287-3p是一个新的miRNA,并预测其可能靶向蜕皮激素受体EcRbl,表明novel-m0287-3p可能参与斜纹夜蛾发育的调控.双荧光素酶实验表明,novel-m0287-3p分别结合于EcRb13'非编码区的2个位点上.实时荧光PCR结果显示novel-m0287-3p和EcRb1均在斜纹夜蛾的中肠中表达.为了进一步揭示novel-m0287-3p对EcRb1表达的调控以及对幼虫发育的影响,本研究进行了体内实验.将novel-m0287-3p的模拟体类似物注射入斜纹夜蛾幼虫,结果显示斜纹夜蛾体内EcRb1的mRNA水平发生了下调,证明novel-m0287-3p能够抑制幼虫EcRb1的表达.向4龄第1天的斜纹夜蛾幼虫注射novel-m0287-3p后,幼虫的生长受到抑制;而注射斜纹夜蛾6龄幼虫则导致其化蛹滞后.研究结果表明,novel-m0287-3p可通过调控蜕皮激素受体EcRb1的表达,从而影响斜纹夜蛾的生长发育.

[目的]为探究核受体超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)在白背飞虱Sogatella furcifera若虫蜕皮发育过程中的功能及其与几丁质合成和降解之间的调控关系.[方法]基于白背飞虱基因组数据,结合RT-PCR克隆SfUSP全长cDNA序列;利用RT-qPCR测定白背飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫、5龄若虫蜕皮前、5龄若虫蜕皮中和雌成虫)、5龄若虫组织(头、体壁、脂肪体、肠道和足)、雌成虫组织(体壁、翅、脂肪体、足和卵巢)以及100 ng/头20E处理后5龄第1天若虫中SfUSP的表达量;通过显微注射dsRNA靶向沉默5龄第1天若虫的SfUSP后,计算若虫存活率,观察若虫致死表型,利用RT-qPCR测定几丁质合成和降解通路关键基因的表达量.[结果]克隆获得了白背飞虱SfUSP(GenBank登录号:ON209396)的全长cDNA序列,其开放阅读框长1 263 bp,编码420个氨基酸,SfUSP蛋白预测分子量为47.27 kD,理论等电点为7.18.序列分析结果表明,SfUSP含有核受体家族所具备的5个保守结构域,并且DNA结合域(DNA-binding domain,DBD)和配体结合域(ligand-binding domain,LBD)高度保守.发育阶段表达谱表明,SfUSP在1龄若虫、5龄若虫蜕皮前以及雌成虫中高表达;组织表达谱显示,SfUSP在5龄若虫头、体壁、脂肪体和肠道中的表达量较高;在雌成虫翅、足和体壁中的表达量较高.显微注射100 ng/头20E后12 h时,5龄若虫中SfUSP的表达量显著高于对照组的.靶向沉默SfUSP表达后,与注射dsGFP的对照组相比,显著降低了白背飞虱的若虫存活率,显微注射dsRNA 6 d时若虫存活率仅为对照组的18.01％,其中不能成功蜕皮个体占51.46％;显著抑制了几丁质合成通路关键基因SfCHS1,SfCHS1a,SfUAP,SfGFAT和几丁质降解通路关键基因SfCht7,SfNAG1,SfNAG2,SfCDA1,SfCDA2和SfCDA4的表达量,但是显著提高了SfG6PI和SfCht10的表达量.[结论]SfUSP是白背飞虱生长发育过程中的关键基因,能够影响几丁质的合成与降解,进而调控白背飞虱的蜕皮发育.

[目的]雌激素雌二醇(E2)在脊椎动物中通过雌激素受体(ER)调节脊椎动物的生长发育和繁殖.昆虫中并没有ER,但有研究显示某些昆虫能对E2产生一定的应答.本研究在明确E2能影响家蚕Bombyx mori卵黄原蛋白基因(BmVg)表达的前提下,分析其对这一基因表达的调控机制.[方法]取BmVg高量表达时的家蚕雌性幼虫(上蔟后60 h)脂肪体,用不同浓度(0.001,0.05,0.5,5和50 nmol/L) E2处理后,通过qRT-PCR检测BmVg表达的变化,分析家蚕对E2的应答;克隆家蚕蜕皮激素受体基因(BmEcRB1),构建原核表达载体,表达并纯化BmEcRB1蛋白后与E2体外孵育,通过微量热泳动仪(MST)分析E2与BmEcRB1的结合情况.[结果]不同浓度E2均显著抑制离体培养的雌蚕脂肪体中BmVg基因的表达.MST实验证实,E2与BmEcRB1具有一定的亲和力,解离常数(Kd)为77.8±22 μmol/L.[结论]结果说明,E2对BmVg表达的影响是通过与蜕皮激素(20E)竞争性结合BmEcRB1实现的.

为探究蜕皮激素早期应答因子ecr和usp在不同级型的西方蜜蜂体内的表达及其他相关生物学功能和作用,本研究通过荧光定量PCR技术对不同级型、发育时期的西方蜜蜂中的ecr与usp表达水平进行检测.结果表明,ecr、usp在工蜂小幼虫体内的表达与参照相同,随后稍有增加,但在变态期急剧降至最低水平,而后的蛹期又逐步增加,在成年蜂时期的表达持续维持在较高水平;蜂王体内的变化趋势与工蜂基本类似,所不同的是各阶段的表达量都显著高于工蜂,且在产卵王体内的表达显著高于处女蜂王;雄蜂体内ecr的表达在小幼虫时期稍高,但此后至蛹期都一直处于较低的表达水平,至蛹后期才稍有增加,但羽化后水平较低,老龄雄蜂体内又稍有提高.但usp在雄蜂体内的表达却基本呈现出与发育时期无关的高表达,大致为参照的283倍.ecr与usp在三型蜂体内的这种表达模式揭示了MH不仅调控蜜蜂生长发育、蜕皮变态,还可能与蜜蜂的生殖有关,而usp在雄蜂体内的表达说明USP除了与EcR组成活性复合体参与MH调控蜕皮与生殖外,还可能具有其他的生物学功能.该结果为进一步研究蜕皮激素及其效应因子的生物学功能提供了依据.

昆虫通过多种激素调控蜕皮过程,以完成生长发育.鞣化激素与其受体结合,调节昆虫表皮发育及鞣化、翅的伸展和成熟、肌肉收缩、卵子边缘细胞的迁移等,对昆虫的生长发育具有重要作用.鞣化激素由两个亚基(BURS和PBURS)构成,主要在胸腹神经节中合成,两个亚基在结构及其进化上较为保守,氨基酸序列中均含有11个半胱氨酸残基,在某些特定的组织中具有独立的生物学活性.鞣化激素受体为G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)亚家族成员,富含亮氨酸重复序列,被命名为dLGR2.LGR2的C端区域(含多个丝氨酸残基)和N端区域(富含亮氨酸重复结构域)对于其行使正常功能具有重要作用.鞣化激素释放至血淋巴中与LGR2结合,激活cAMP/PKA信号,使酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)磷酸化,磷酸化的TH将酪氨酸(Tyrosine)羟化为多巴(DOPA),进而引起表皮的黑化和硬化过程.另外,昆虫鞣化激素亚基形成的同源二聚体可激活转录因子Relish,调控免疫反应.本文结合近年来该领域研究成果,对鞣化激素及其受体的分子结构特性和时空表达进行分析,同时,对其在翅的延展和成熟、表皮黑化和硬化以及免疫等方面的功能研究进展进行综述,为深入认识昆虫鞣化激素及其受体作用机制提供参考.

蜜蜂是整个大自然生态系统中不可或缺的一部分,能有效地为多种植物和农作物授粉.蜜蜂是典型的真社会性昆虫,其生殖劳动分工现象有重要进化意义.而级型分化是导致劳动分工的一个重要因素,蜜蜂级型分化现象的机理研究已成为目前重要的研究热点之一.本文对近年来蜜蜂级型分化机理方面的研究进展进行了综述.国内外很多学者从营养、激素、基因表达、蛋白质和表观遗传等方面对蜜蜂级型分化机理进行了研究.蜂王浆中富含的57 kDa、蜂王幼虫期充足的食物量以及蜂王幼虫期高滴度的保幼激素(JH)和蜕皮激素(MA)等都可促进蜂王卵巢的发育以及诱导蜂王表型产生;而工蜂浆中富含的双香豆酸可诱使工蜂表型的产生.近年研究表明,表皮生长因子受体(Egfr)、胰岛素受体底物基因(Irs)、雷帕霉素基因(Tor)和甲基转移酶3(Dnmt3)等基因均可影响蜂王和工蜂的分化;蛋白质表达谱分析表明,不同时间点的蜂王幼虫和工蜂幼虫表达的差异蛋白质很多;表观遗传分析表明,DNA甲基化、microRNAs以及组蛋白乙酰化均是导致蜂王和工蜂级型分化的因素.此外,发育空间和蜂王浆均可通过调控基因的DNA甲基化水平影响蜜蜂幼虫的级型分化.

[目的]酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是黑色素形成的关键酶,在昆虫表皮骨化过程中扮演重要角色.本研究旨在获得棉铃虫Helicoverpa armigera TH基因序列,并研究其分子特性、表达模式和功能,为更深入探析该基因作用机理奠定基础.[方法]通过生物信息学和分子生物学技术获得了棉铃虫TH基因序列,利用qRT-PCR分析该基因在棉铃虫不同生长发育阶段的表达模式;利用qRT-PCR技术,分别测定了蜕皮激素20E(400 ng/头)处理不同时间和RNAi成功干扰蜕皮激素受体基因(EcR)前提下再用20E(400 ng/头)处理后,棉铃虫5龄幼虫TH表达量变化;采用生物化学方法检测鞣化激素(30 μg/mg组织)和环腺苷酸(cAMP,200 ng/mg组织)处理后棉铃虫幼虫脂肪体中TH活性.[结果]获得了棉铃虫酪氨酸羟化酶基因TH(GenBank登录号:MF440319) cDNA片段,长2 270 bp,开放阅读框1 686 bp,编码561个氨基酸残基.该基因在棉铃虫整个发育期均表达,其中在卵期第3天、2龄幼虫第1天、3-5龄蜕皮期、预蛹期和成虫羽化第1天表达量相对较高.研究还发现,400 ng/头20E注射能够促进TH的转录;在成功干扰并调低幼虫EcR转录水平的前提条件下(对照仅注射dsGFP)再注射20E,对TH表达量无明显影响;而鞣化激素(30 μg/mg组织)和cAMP(200 ng/mg组织)均显著提高了TH的酶活性.[结论]20E在转录水平参与了TH的表达;鞣化激素和cAMP均能够提高TH活性,在蛋白水平上对TH进行调控.

[目的]昆虫脂肪体是物质合成代谢、先天免疫的重要器官.ATG8蛋白的亚细胞定位是细胞自噬的主要指标之一,细胞核皱缩是细胞凋亡的形态标记之一,目前家蚕Bombyx mori中尚未在蜕皮和变态发育进程中对BmATG8蛋白的细胞生物学变化进行观察.本研究旨在同时检测家蚕脂肪体细胞中BmATG8蛋白亚细胞定位和细胞核皱缩的时空变化,研究蜕皮激素(20E)信号对两者的调控作用.[方法]利用免疫荧光和Hoechst染色方法,分别在家蚕幼虫4龄第2天至预蛹第2天、5龄第2天幼虫注射20E(10 μg/头)后以及对游走期幼虫脂肪体中20E受体基因usp进行RNAi后,检测家蚕脂肪体中BmATG8蛋白定位和细胞核形态变化.[结果]在家蚕幼虫蜕皮和幼虫-蛹变态发育时期,BmATG8蛋白高水平存在于脂肪体细胞中,同时细胞核发生皱缩.在正常摄食时期,20E处理(10 μg/头)能够诱导细胞中大量出现BmATG8蛋白且存在于细胞质中并诱导细胞核皱缩.对usp基因进行RNAi后,脂肪体细胞内的BmATG8蛋白显著减少,同时细胞核皱缩减弱.[结论]家蚕BmATG8蛋白不仅在幼虫-蛹变态时期细胞质中大量存在,而且在幼虫蜕皮时期也大量表达,与细胞核的皱缩同时出现,BmATG8蛋白在细胞质中的定位与细胞核皱缩两者均受到20E信号通路的调控.本研究为BmATG8蛋白功能及其调控机制的深入研究提供了重要的科学依据.