己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66 的关键前体.目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题.本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli)FMME N-2 为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成 0.34 g/L己二酸的E.coli JL00 菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E.coli JL01 菌株在摇瓶发酵条件下产量达到 0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E.coli JL12 己二酸产量进一步提升至 1.51 g/L;最后,在 5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化.工程菌株经 72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到 22.3 g/L,转化率为 0.25 g/g,生产强度为 0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力.本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础.

水杨酸葡萄糖苷(salicylate 2-O-β-D-glucoside,SAG),是植物中水杨酸的一种存在形式.水杨酸葡萄糖苷也具有消炎止痛的作用,和水杨酸、阿司匹林对比,表现出更小的刺激性,是一种具有潜力的消炎护肤物质.通过生物法利用可再生资源进行水杨酸类物质的生产方式,与传统工业法生产相比对环境更加友好.本研究以大肠杆菌(Escherichia coli)Tyr002 作为出发菌株,引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)异分支酸裂解酶基因pchB,首先构建了大肠杆菌水杨酸生产菌株.通过调控下游不同芳香族氨基酸代谢途径关键基因表达,菌株摇瓶发酵水杨酸产量达到1.05 g/L.之后,通过在水杨酸生产菌株中引入植物来源水杨酸糖基转移酶,对水杨酸进行糖苷化修饰.新构建的菌株摇瓶发酵水杨酸葡萄糖苷产量达到 5.7 g/L.在 5 L发酵罐分批补料发酵中,水杨酸葡萄糖苷的产量达到 36.5 g/L,是目前报道的最高产量.本研究为水杨酸类化合物的微生物合成提供了重要参考.

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业.以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01 为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发酵副产物丙氨酸含量.其次,α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用,因此,采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性,强化了谷氨酸合成代谢流.同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶,加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力.接着,对谷氨酸转运蛋白进行理性设计,提高了谷氨酸的外排能力.最后,对基于以上策略构建的整合菌株进行了 5 L发酵罐发酵优化,通过梯度升温结合分批补料策略,谷氨酸产量为(136.33±4.68)g/L,较原始菌的产量(96.53±2.32)g/L提高了 41.2%;糖酸转化率为 55.8%,较原始菌的 44.2%提高了 11.6%;且降低了副产物丙氨酸的含量.以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率,可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考.

该研究以桑白皮药渣为研究对象,对其酶解工艺进行了优化,探究中药药渣作为生产高附加值化学品及生物燃料的潜能.结果显示,桑白皮药渣酸处理前后纤维素质量分数分别为52.5％,47％,含量较高,表明桑白皮药渣有作为生产高附加值化学品及生物燃料的潜能;选取不同酶用量酶解桑白皮药渣,通过比较产糖量以及酶解率,得到最优酶用量为40 FPU·(g DW)-1,此条件下酶解后,桑白皮药渣单批酶解中葡萄糖,木糖,阿拉伯糖质量浓度达到23.82,4.84,3.6 g·L-1,酶解率为45.33％,是未进行酸处理药渣的2.3倍;最后通过分批补料酶解策略,进一步提高桑白皮药渣的产糖量,最终葡萄糖浓度达到38 g·L-1,酶解率为36.19％.从本研究结果来看,桑白皮药渣中纤维素和半纤维素含量高,具有作为生产高附加值化学品及生物燃料的潜能,通过酶解的方式,将其转化为微生物可利用的单糖,通过发酵将其转化为高附加值的化学品、生物燃料等,解决药渣污染等问题,从而实现中药制药生产过程的可持续化,绿色化.

内生真菌发酵法是解决紫杉醇药源短缺问题的有效途径之一.本研究以摇瓶分批发酵为基础,进行摇瓶补料分批发酵研究,探究了苯丙氨酸、甘氨酸、苯甲酸钠乙酸钠混合液、3,5-二硝基水杨酸、H2O2、CuSO4在发酵周期(13d)中,不同添加时间点对TMS-26菌体量及紫杉醇产量的影响,发现在第8天添加苯丙氨酸、甘氨酸、3,5-二硝基水杨酸时,其产量分别达到了(664.80±40.34)pg/L、(628.72±30.44mg/L、(641.36±19.62)μg/L;在第9天添加CuSO4时,其产量达到了(697.46±15.76)μg/L;在第10天添加H2O2、苯甲酸钠乙酸钠混合液,其产量分别达到了(615.78±36.28)μg/L、(792.54±10.04)μg/L.在摇瓶补料分批发酵研究结果的基础上,进行了5L罐发酵工艺放大研究,探究了前体和诱导子通过进行一次补加和恒速补加的方式对Aspergillus fumigatus TM S-26菌体量及紫杉醇产量的影响,结果表明恒速补加苯丙氨酸乙酸钠混合液,紫杉醇产量达到了746.17μg/L.通过本次研究,优化了TMS-26产紫杉醇摇瓶补料分批发酵和5L罐发酵工艺,为后续实现紫杉醇工业化生产奠定基础.

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是我国新近批准的一种天然食品防腐剂,由链霉菌好氧发酵制备而来.通过传统育种手段强化产生菌ε-PL合成能力是提高其发酵水平的重要途径,然而高产改造菌与出发菌株发生的生理改变却很少被关注.本研究从培养特征,营养需求和发酵过程参数等方面进行比较与分析,发现高产菌株Streptomyces albulus GS114具有需氧量小、菌体量低、ε-PL产量高、单位菌体ε-PL合成能力强、转化率高等特点.为了进一步提高S.albulus GS114的ε-PL产量,通过提高pH冲击策略中预培养pH增加其菌体量,实现ε-PL产量达到53.49 g/L,较优化前提高了11.9％.研究结果将为ε-PL工业化生产奠定基础.

木糖利用能力和抑制物耐受能力优良的工业酿酒酵母菌株以及合理的糖化发酵工艺是纤维素燃料乙醇生产的两个关键.对一株工业酿酒酵母菌的磷酸戊糖途径转醛醇酶基因TAL1进行差异过表达, 评价其在8种典型抑制物存在时对菌株利用木糖的影响;利用TAL1过表达菌株研究油菜秸秆预处理物料中抑制物含量高低对分步糖化发酵 (SHF) 、预糖化-同步糖化发酵 (P-SSF) 和同步糖化发酵 (SSF) 3种不同糖化发酵方式发酵过程的影响, 探讨高固含量发酵的可行性.结果显示, TAL1基因过表达提高了菌株的木糖代谢能力和对8种典型抑制物的耐受能力, 适度过表达菌株表现最优, 有抑制物存在时的木糖消耗速率提升了20％-70％.秸秆预处理物料中抑制物总含量约为4 g/L时, SHF无法正常发酵, SSF的乙醇收率接近70％, 略高于P-SSF;当物料中抑制物总含量下降到约2 g/L时, 3种方式都能顺利发酵, SSF表现最优, 96 h时的乙醇收率为86.5％, 但SSF (96 h) 和P-SSF (112 h) 所需糖化发酵总时间远低于SHF (144 h);总固含量约为25％的分批补料-同步糖化发酵 (FB-SSF) 的乙醇浓度和乙醇收率分别达到54.2 g/L和67.2％.上述结果表明, TAL1基因适度过表达提升了菌株的木糖发酵和抑制物耐受能力, 菌株已具备比较优秀的发酵和耐受抑制物的能力;预处理物料中抑制物含量相对较高时采用SSF或P-SSF工艺, 而抑制物浓度相对较低时, 3种糖化发酵方式都可以采用, 但SSF所需发酵时间最短, 生产能力最高.

左旋多巴是治疗帕金森氏病的首选药物,生物酶法合成左旋多巴具有工艺简单、条件温和、立体选择性高和环境友好等优点.本论文以实验室前期构建的表达具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)TPL(Fn-TPL)的重组大肠杆菌为基础,采用单因素实验通过对5L发酵罐发酵工艺优化以及补料策略的研究,确定了分批发酵的工艺参数:pH 6.5,诱导温度30℃,诱导剂乳糖20 g/L.在5L发酵罐中,进一步研究了10 mL/h、20 mL/h、30 mL/h三个速率的恒速流加对菌体生物量和TPL酶活的影响.结果表明,补料速率为20 mL/h时,生物量最高为30.43 g dcw/L,体积酶活最高为9 420 U/L,较摇瓶发酵培养活力提高了3.3倍.

lysC、asdA基因分别编码的天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate semi-aldehyde dehydrogenase,ASD)是L-苏氨酸合成途径中两个关键限速酶基因,其中AK受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制.以选育获得的一株谷氨酸棒状杆菌T11(Corynebacterium glutamicum T11)为出发菌株,通过构建lysC-asdA串联表达盒,并对其关键限速酶基因lysC进行定点突变,突变位点为Ala279Thr,获得抗反馈抑制突变型编码基因lysCr-asdA,将其插入含强启动子tac的穿梭表达载体pZ8-1中成功构建串联表达质粒pZ8-1-lysCr-asdA转化出发菌株,筛选获得工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA.摇瓶发酵其L-苏氨酸产量达到7.18 g/L,较出发菌株提高27.8％.进一步的30 L发酵罐补料分批发酵结果显示,发酵60 h L-苏氨酸产量达65.5 g/L,糖酸转化率达到39.5％,较出发菌株分别提高29.5％ 和33.9％,为后续的进一步构建高产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株提供强有力的基础.

筛选噬菌体抗性菌株以解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生产过程中噬菌体污染问题并提高抗性菌株的发酵水平.采用双层平板法从异常发酵液中分离并纯化以枯草芽孢杆菌为宿主的噬菌体,利用纯化得到的噬菌体筛选实验室芽孢杆菌库以得到抗性菌株,结合16S rDNA和yrA基因序列进行系统发育分析确定其分类地位,以分批发酵的生长曲线及葡萄糖含量曲线作为基础,对发酵培养基的初糖浓度及葡萄糖的流加方式进行优化提高筛选到的噬菌体抗性菌株的发酵水平.从异常发酵液中分离到噬菌体S01及S02并在实验室芽孢杆菌库中筛选到一株噬菌体无法侵染的芽孢杆菌BS-2,结合16S rDNA及gyrA基因序列的系统发育分析将BS-2鉴定为枯草芽孢杆菌,按照葡萄糖初始浓度15 g/L,葡萄糖浓度低于5g/L时以2 g/L·h的速度流加葡萄糖,补加量10 g/L的流加补料方法,可以将发酵水平提高至2.43×1010 CFU/mL.枯草芽孢杆菌BS-2具有较好的噬菌体抗性且经过工艺优化可以达到较高发酵水平,有较强工业化应用潜力.