外泌体是一种机体内大多数细胞分泌的直径为30~150 nm，具有脂质双层膜的微小囊泡，可以直接反映分泌细胞的生理和功能状态，参与细胞间的物质运输和信息通讯，其作为肿瘤早期诊断和治疗评估的生物标志物具有重要意义。外泌体的检测方法有很多，在这些检测方法中，适配体传感器技术以其价廉易用、响应快、灵敏度高、特异性强等特点，帮助肿瘤患者早期发现，早期获得诊断，早期治疗，提高生存率，并为愈后效果的评价提供了重要依据。常见的适配体传感器有荧光、电化学、比色法、光致发光、横向流动带、表面增强拉曼散射和表面等离子体共振适配体传感器，不同的适配体传感器具有不同的特征，文章对几种常见适配体传感器检测肿瘤外泌体的研究进展进行阐述。

目的:筛选血管炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）的DNA适体，并建立以非标记核酸适体-纳米金为探针的可视化检测方法。方法:方法学建立。通过磁珠固定SELEX技术经孵育结合、ssDNA分离、PCR扩增、单链回收的8轮循环筛选Lp-PLA2适体，利用表面等离子体共振技术和流式细胞术验证适体的亲和力和特异性，并通过计算机软件模拟适体二级结构及其与靶蛋白的三维分子对接。随后制备适体-纳米金复合物，利用靶标竞争结合导致纳米金溶液在盐诱导下凝聚引起颜色变化，分光光度计检测溶液的吸光度检测靶标浓度，建立样品溶液中Lp-PLA2浓度与吸光度的线性关系。结果:筛选获得3条高亲和力、强特异性的Lp-PLA2核酸适体B76-2、B76-4及B76-5，解离常数分别为1.07、1.26及1.75 nmol/L；并成功基于B76-2适体构建纳米金比色传感方法，其线性范围和检测限分别是20~500 ng/ml和78 ng/ml，反应时间30 min，可特异性区分靶标与其他血栓标志物如凝血酶和髓过氧化物酶。结论:利用核酸适体-纳米金显色实现了简单、快速、特异的Lp-PLA2可视化检测。

目的 本研究旨在通过对LBP1C-2靶向Kvβ.2构效关系的探索,阐明LBP1C-2靶向Kvβ.2的活性结构域,为开发具有潜在抗早老痴呆活性的创新药物提供科学依据.方法 枸杞多糖LBP1C-2经部分酸水解得到不同的结构片段后,对其进行单糖组成和分子量分析.通过蛋白芯片挑选出潜在靶蛋白,再用表面等离子体共振(SPR)技术验证各结构片段的靶向性.蛋白质免疫印迹以及细胞免疫荧光测试验证其生物学功能.结果 通过HuProtTM人类蛋白质组芯片高通量筛选到LBP1C-2的潜在靶蛋白Kvβ.2.SPR实验表明LBP1C-2与Kvβ.2蛋白有较强结合,其结合常数KD为1.9×10-7 M.而LBP1C-2的化学降解后各结构片段与靶蛋白Kvβ.2有不同强度结合.其中含鼠李糖和半乳糖醛酸摩尔比为1:1的片段LBP1C-2-1I(18.1 kDa)与原多糖LBP1C-2对Kvβ.2结合强度相近为3.3×10-7 M.对LBP1C-2-1I结构解析表明其有1,2-Rha与1,4-GalA交替连接组成.而该片段对应的酸水解外液部分LBP1C-2-1O与Kvβ.2也有结合,但与其他片段与该蛋白解离相比,更容易解离.从BV2小胶质细胞中敲减KCNAB2基因(Kvβ.2)后,BV2细胞中Aβ的降解被抑制,表明蛋白Kvβ.2可能是早老痴呆发生发展中的一个功能蛋白.结论 LBP1C-2靶向Kvβ.2的主要活性结构域为1,2-Rha与1,4-GalA交替连接组成的主链核心骨架结构.本研究为深化了解LBP1C-2潜在的抗早老痴呆活性提供了重要线索,为基于枸杞多糖抗早老痴呆靶向性药物的设计和开发提供了证据.

蛇毒已被证明具有抗炎活性,其中包含许多免疫原性弱、活性强的短肽小分子.蛇毒腺是分泌毒液的器官,含有毒素成分及调控其分泌过程的大量生物活性成分.缓激肽2型受体(B2R)参与重要的细胞内信号通路,作为炎症的调节因子成为潜在的抗炎药物开发的靶点.为了获得特异性的B2R结合肽,利用尖吻蝮蛇Deinagkistro-don acutus毒腺T7噬菌体文库对靶点B2R进行3轮生物淘选,测序获得了多个具有潜在结合能力的序列.通过序列长度、溶解性预测、稳定性预测和分子对接等一系列生物信息学分析,最终确定1个含25个氨基酸的肽段,命名为DAvp-4.合成该肽段,通过表面等离子体共振技术验证了DAvp-4和B2R的结合能力,在脂多糖诱导的巨噬细胞模型及糖尿病视网膜病变小鼠模型中肯定了其抗炎作用.此研究不但获得了一个具有成药潜力的毒腺多肽,还显示了噬菌体展示技术在筛选天然产物成分研究中的有效性.

由于间皮素(MSLN)在多种实体瘤中广泛表达而在正常间皮细胞上表达较低,可作为实体瘤治疗的重要靶点.研究旨在通过将具有较高亲和力的重组抗人MSLN IgG1型单克隆抗体(rhMSLN mAb)序列构建到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.4中,采用Expi293F细胞系高效表达重组单克隆抗体rhMSLN mAb,并采用表面等离子体共振和流式细胞术对其结合活性进行初步探究,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法鉴定其介导的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC).研究结果表明,rhMSLN mAb在Expi293F细胞中以特定条件进行瞬时表达的产量可达70.2 mg/L,与MSLN重组蛋白的亲和力为7.02 nmol/L,对人胃癌细胞(NCI-N87细胞)ADCC作用的EC50为2.48×10-3 μg/mL,为靶向MSLN生物技术药物开发及生产提供了前期探索性支持.

分子间相互作用的表征技术是阐明细胞生物学事件、了解疾病发生机制、辅助药物研发的有力手段.近年来,分子间相互作用的表征技术发展迅速,不断向着高灵敏度、高通量、极短时间、极低检测限的方向发展.本文对表面等离子体共振、生物膜干涉、背向散射干涉以及微量热泳动这 4 种常见的、基于光学检测的分子间相互作用表征技术的原理、特点及最新应用进展进行了综述与比较,为分子间相互作用表征技术的选择提供参考.

目的:研究七白粉的皮肤美白作用,并结合网络药理学和分子对接技术预测其达到美白效果的作用机制.方法:采用紫外线B波段(UVB)照射诱导豚鼠皮肤色素沉着,建立动物模型.观察七白粉对模型豚鼠的美白效果,同时检测黑色素细胞数和超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、酪氨酸酶(TYR)及脂褐质(LF)等与皮肤色素沉积相关的生化指标.利用网络药理学预测七白粉美白的作用机制,并通过分子对接和表面等离子体共振(SPR)进行验证.结果:在动物实验中,与模型组比较,七白粉可显著改善皮肤亮度,且黑色素细胞数和TYR、LF、MDA水平均显著降低,而SOD水平显著升高.网络药理学研究发现七白粉通过儿茶素没食子酸酯、茯苓酸C、别欧前胡素等关键成分,作用于蛋白激酶B α(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGFR)等关键靶标,调控磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)和TNF等信号通路改善黑色素沉积而发挥美白作用.分子对接和SPR结果显示关键成分与关键靶标有较好的亲和力.结论:七白粉可通过抗氧化和抑制TYR的活性达到美白皮肤的效果.此外,七白粉通过多成分作用于多靶点,调控多通路改善黑色素沉积而发挥美白作用,体现了中药复方君臣佐使相互协同,多成分,多靶点,多通路的特点.

目的·研究恒河猴(Rhesus)、狨猴(Marmoset)、倭狐猴(Mouse Lemur)这3种代表性灵长类动物的癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员之一的肉瘤抗原l(sarcoma antigen 1,SAGE1)的进化,及其与整合体复合物(integrator complex,INT)亚基INTS3之间的相互作用的保守性.方法·首先在HEK293T细胞中利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)的方法验证3种灵长类动物的SAGE1和INTS3相互作用.随后在互作蛋白截短的片段上分别添加His-SUM O和GST标签,并在大肠埃希菌中进行表达,经过系列纯化步骤得到目标蛋白.通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)实验测定目标蛋白之间的结合强弱,借助广角激光散射凝胶排阻层析(size exclusion chromatography with multi-angle light scattering,SEC-MALS)技术检测复合物的结合比例,并利用分子对接技术预测SAGE1和INTS3截短体的结合模型.分析人类INTS3和SAGE1互作界面,挑选在灵长类中也相对保守的关键互作氨基酸位点,将其突变后再次使用Co-IP分析INTS3和SAGE1的结合情况.结果·通过Co-IP方法,确定3种灵长类动物中INTS3和SAGE1全长蛋白之间存在相互作用.截短体蛋白经过外源诱导表达和多步纯化,获得高纯度蛋白样品;经过SPR对其进行结合和解离检测分析,得到了它们的解离常数在微摩尔级别;并且SEC-MALS结果显示INTS3与SAGE1的结合比例为2∶1.使用分子对接预测SAGE1和INTS3截短体结合模型,发现该复合物具有典型的"蝴蝶型结构",由INTS3二聚体组成"蝴蝶身体",由SAGE1组成"蝴蝶头部",结合界面中疏水相互作用构成了主要的互作模式.分析突变后的SAGE1与INTS3全长蛋白相互作用,它们之间的结合明显减弱.结论·恒河猴、狨猴、倭狐猴中INTS3与SAGE1存在相互作用,并且相互作用具有高度的保守性.

表面等离子体共振生物传感器是基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)原理发展起来的新型生物传感技术,具有免标记、特异性强、灵敏度高、可实时动态检测等特点,在分子互作、药物筛选等领域具有独特优势.世界各国都在加紧布局SPR生物传感器技术的知识产权,我国近年来在该方向的知识产权申请量显著增加.基于IncoPat专利数据库,对SPR生物传感器技术的总体发展态势、知识产权布局、热点技术构成等进行深入分析,并对关键知识产权进行识别.研究结果表明,我国在SPR生物传感器领域的研究日益活跃,专利申请数量处于世界领先地位,但是存在原创性知识产权数量少、知识产权转化率有限、产品市场占有率偏低等问题.鉴于SPR生物传感器的广阔市场前景,提出了我国SPR生物传感器技术的未来发展战略.

目的 基于表面等离子共振(SPR)技术建立抗CD80 生物技术药物结合活性方法,并进行方法学验证和样品测定.方法 通过优化试验条件建立合适的结合活性方法,并选择合适的数据分析模型后对建立的方法进行方法学验证.结果 通过对各种条件进行筛选及耐用性考察,确定了方法的试验参数:配体固定条件为pH 5.0 的醋酸盐缓冲液,固定量为 400～5000 RU,结合和解离速率为 10～50μL·min-1,芯片的再生条件为pH 4.0 的枸橼酸缓冲液(10 mmol·L-1 枸橼酸钠,100 mmol·L-1 NaCl),响应参数为稳态相对响应值(在进样结束后 10 s范围内窗口的平均响应值),数据模型为四参数模型.根据以上参数建立了基于SPR技术抗CD80 生物技术药物结合活性方法.验证结果如下:线性回归方程的决定系数为0.9994;每个效价水平相对效价测定值的相对偏倚平均值为-0.66%～0.64%,线性回归方程的斜率为 0.9867;每个效价水平 6 次独立测试结果的几何变异系数为 0.7%～1.5%,范围为 64%～156%.各项验证指标均满足相关验证要求,专属性结果也较好.将建立的结合活性方法应用于抗CD80 生物技术药物,测得结合活性相对效价为 100%.结论 本研究通过优化试验条件建立了基于SPR技术的抗CD80 生物技术药物结合活性方法,该方法专属性强、重复性好、准确度高.