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HO-1在小鼠内毒素急性肺损伤中的作用:与调控线粒体质量控制的关系
编辑人员丨4天前
目的:评价血红素氧合酶-1(HO-1)在小鼠内毒素急性肺损伤中的作用及其与调控线粒体质量控制的关系。方法:清洁级健康雄性成年C57BL/6小鼠,基于CRISPER/Cas9开发的EGE系统制备HO-1诱导性基因敲除小鼠,并构建HO-1过表达腺病毒载体诱导HO-1基因过表达小鼠,6~8周龄,体重20~25 g,采用随机数字表法,将野生型C57BL/6(WT)、HO-1基因敲除型小鼠(HO-1 -/-)和HO-1基因过表达型小鼠(HO-1 +/+)分别分为2组( n=6):对照组(WT组、HO-1 -/-组和HO-1 +/+组)和内毒素急性肺损伤组(ALI组、HO-1 -/-+ALI组和HO-1 +/++ALI组)。经尾静脉注射LPS 15 mg/kg制备小鼠内毒素急性肺损伤模型,各对照组给予等容量生理盐水。给予LPS或生理盐水后12 h时处死小鼠取肺组织,光镜下观察肺组织病理学结果并进行肺损伤评分,测定肺组织还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量,计算GSH/GSSG比值,透射电镜下观察线粒体超微结构,测定线粒体膜电位(MMP)水平,采用Western blot法测定HO-1、线粒体质量控制相关蛋白线粒体融合蛋白2(Mfn2)、动力相关蛋白1(Drp1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、线粒体自噬标志蛋白PTEN诱导激酶1(PINK1)和E3泛素-蛋白连接酶(Parkin)的表达,观察小鼠12 h生存情况。 结果:与对照组(WT组、HO-1 -/-组和HO-1 +/+组)比较,内毒素急性肺损伤组(ALI组、HO-1 -/-+ALI组和HO-1 +/++ALI组)小鼠12 h生存率和MMP降低,肺损伤评分增加,GSH含量和GSH/GSSG比值降低,GSSG含量升高( P<0.05);与ALI组比较,HO-1 -/-+ALI组小鼠12 h生存率和MMP降低,肺损伤评分增加,GSH含量和GSH/GSSG比值降低,GSSG含量升高,HO-1、Mfn2、PGC-1α、NRF1、PINK1和Parkin表达下调,Drp1表达上调,HO-1 +/++ALI组小鼠12 h生存率和MMP升高,肺损伤评分降低,GSH含量和GSH/GSSG比值升高,GSSG含量降低,HO-1、Mfn2、PGC-1α、NRF1、PINK1和Parkin表达上调,Drp1表达下调( P<0.05)。与WT组比较,HO-1 -/-组肺组织HO-1表达下调,HO-1 +/+组肺组织HO-1表达上调,ALI组肺组织HO-1、Drp1、PINK1和Parkin表达上调,Mfn2、PGC-1α和NRF1表达下调( P<0.05)。 结论:HO-1参与了小鼠内毒素急性肺损伤的过程,与调控线粒体质量控制有关。
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编辑人员丨4天前
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脊髓Caprin-1介导的CaMKⅡα表达与小鼠痛觉感知的关系
编辑人员丨4天前
目的:评价脊髓胞质活化/增殖相关蛋白1(Caprin-1)介导的钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡα)表达与小鼠痛觉感知的关系。方法:通过Nestin CreERT2小鼠与Caprin-1 flox/flox小鼠多代杂交,获得Nestin CreERT2;Caprin-1 flox/flox纯合子小鼠,采用随机数字表法分为2组( n=5):Nestin CreERT2;Caprin-1 flox/flox溶剂对照组(SC组)和Caprin-1敲除组(KO组)。KO组连续5 d腹腔注射他莫昔芬100 mg/kg,以诱导性敲除Caprin-1基因,SC组给予等容量溶剂。于连续给药前1 d和给药结束后5 d时测定机械缩足反应阈(MWT)。随后处死小鼠,取脊髓L 4-6节段,采用Western blot检测脊髓Caprin-1、CaMKⅡα表达,采用实时定量PCR法检测脊髓Caprin-1、CaMKⅡα的mRNA表达,采用免疫荧光双标染色检测Caprin-1与CaMKⅡα共表达情况。 结果:与SC组比较,KO组他莫昔分给药结束后5 d时MWT升高,脊髓Caprin-1及其mRNA、CaMKⅡα及其mRNA表达下调( P<0.05),Caprin-1与CaMKⅡα在脊髓背角共定位表达下调。 结论:脊髓Caprin-1可通过促进CaMKⅡα表达,参与小鼠痛觉感知的形成。
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编辑人员丨4天前
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新生小鼠大脑中生长激素受体阳性神经元的分布和功能
编辑人员丨3周前
目的 探讨生长激素受体(GHR)阳性神经元在新生小鼠大脑中的分布及功能.方法 选取6只GHR-CreERT;mTOMATO/mGFP荧光报告基因小鼠,均在出生后第3天使用他莫昔芬诱导,在第10天和第17天分别取材3只,观察不同发育阶段大脑中GHR阳性神经细胞的分布.构建GHR floxed小鼠,通过与神经元特异性Thy1-CreERT;YFP小鼠杂交,诱导性敲除神经元中GHR.对照小鼠(GHR fl/fl 4只)和条件敲除小鼠(Thy1;GHR fl/fl 4只),在出生后第3天诱导,于第10天取材,用于观察神经元GHR信号对大脑发育的影响.结果 GHR荧光报告基因小鼠显示GHR阳性细胞在新生小鼠大脑中广泛表达,GHR阳性神经元集中在下丘脑室旁核(PVN);特异性敲除新生小鼠大脑神经元中的GHR,神经元以及各类胶质细胞的单位面积数量未见明显差异.结论 GHR阳性神经元主要集中在下丘脑PVN,敲除发育大脑神经元的GHR不能明显改变各种神经元和神经胶质等细胞的形态和密度.
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编辑人员丨3周前
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微小染色体维持蛋白2基因诱导性敲除宫颈癌HeLa细胞系的建立及对DNA复制的影响
编辑人员丨2024/3/30
目的 利用诱导性CRISPR/Cas9 技术建立微小染色体维持蛋白2(MCM2)基因敲除的宫颈癌HeLa细胞系,并探究MCM2对DNA复制及复制压力的影响.方法 使用诱导性 CRISPR/Cas9系统TLCV2,构建MCM2敲除HeLa细胞系;并分为对照组(Control)、敲除1组(KO1)和敲除2组(KO2).通过Western blot、EdU掺入实验、实时定量PCR、免疫荧光、CCK-8等实验,分析MCM2敲除对DNA复制和羟基脲诱导复制压力的影响.结果 经过诱导后CRISPR/Cas9系统有效地敲除MCM2基因,并影响MCM2-7复合物的稳定.与对照细胞相比,MCM2敲除细胞DNA复制能力显著下降,同时Cyclin A1、Cyclin E1和CDK4的mRNA表达水平降低.在DNA复制压力下,MCM2敲除降低了细胞的存活能力、DNA损伤修复能力,并增加基因组的不稳定性.结论 MCM2基因敲除降低正常条件下HeLa细胞的DNA复制能力,并降低复制压力后细胞的存活能力.本研究成功地构建了诱导性MCM2基因敲除HeLa细胞系,为进一步研究MCM2基因在宫颈癌中的作用及其生物学功能奠定了基础.
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编辑人员丨2024/3/30
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诱导性ppp2r1a基因敲除小鼠模型的表型和机制研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 研究诱导性ppp2r1a基因全身敲除对成年小鼠的主要生理功能影响并探讨相关机制.方法 将ppp2r1aflox/flox小鼠和CAGG-CreER小鼠杂交繁殖,获得20只CAGG-CreER ppp2r1aflox/flox小鼠,设立为纯合子组,并同时选取同窝野生型小鼠20只,采用单纯随机法,将纯合子、野生型小鼠分别分为4组,共8组,每组5只,腹腔注射他莫昔芬0、2、4、6 d,建立ppp2r1a基因诱导性敲除小鼠模型.采用Western blot法检测主要脏器中PP2A Aα(由ppp2r1a基因编码)的敲除效率,并观察小鼠体重、脏器病理改变以及外周血细胞计数和血生化,采用Real-time PCR法检测肝脏糖脂代谢相关基因的表达改变.结果 他莫昔芬注射6 d后,小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑的PP2A Aα敲除效率分别约为35%、12%、15%、60%、69%和72%.他莫昔芬注射6 d后,纯合子小鼠体重[(17.42±1.76)g]低于野生型小鼠[(21.69±1.82)g](P<0.05).纯合子小鼠活动减少,腹部和肾周脂肪少,存活不超过7 d.第6天后,纯合子小鼠脾脏的脏器系数[(0.36±0.05)%]低于野生型小鼠[(0.59±0.10)%](P<0.05),组织病理HE染色显示脾脏萎缩明显,有核细胞明显减少.Tunel染色发现脾脏中淋巴细胞凋亡增多.纯合子小鼠血浆中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平[(153.68±62.80)U/L和(193.2±44.28)U/L]均高于野生型小鼠[(41.02±12.91)U/L和(69.40±9.55)U/L](P值均<0.05),提示ppp2r1a敲除导致肝损伤.纯合子血糖水平[(4.20±1.99)mmol/L]低于野生型[(8.88±0.65)mmol/L](P<0.05),而总胆固醇、HDL-C和β-羟基丁酸(β-HB)水平[(3.12±0.39)、(1.53±0.38)和(2.49±0.89)mmol/L]均高于野生型小鼠[(1.69± 0.92)、(0.78±0.50)和(0.45±0.30)mmol/L](P值均<0.05),表明ppp2r1a敲除会扰乱葡萄糖和胆固醇代谢.此外,纯合子小鼠白细胞计数(WBC)和淋巴细胞计数[(1.88±0.89)×109/L和(0.92±0.37)×109/L]低于野生型小鼠[(3.91±0.80)×109/L和(2.74±0.52)×109/L](P值均<0.05).纯合子小鼠肝脏中糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的mRNA相对表达水平[(0.46±0.11)和(0.72±0.07)]均低于野生型小鼠[(1.02±0.07)和(1.02±0.06)](P值均<0.05).结论 全器官ppp2r1a基因对成年小鼠的存活是必不可少的,且ppp2r1a基因可能通过调控肝脏葡萄糖和胆固醇代谢发挥重要作用.
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编辑人员丨2023/8/6
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缝隙连接蛋白26对小鼠噪声易感性的影响
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨降低耳蜗缝隙连接蛋白26 (connexin 26,Cx26)表达对暴露于噪声环境中小鼠噪声易感性的影响.方法 条件诱导性Cx26基因敲除新生小鼠32只,随机分为空白组、他莫昔芬(tamoxifen,TMX)组、噪声组、噪声+TMX组各8只,TMX组于出生第18天给予单次TMX(1.5 mg/10 g)皮下注射;噪声组于出生第24天开始暴露于100 dB声压级(sound pressure level,SPL)稳态白噪声中,每日连续8h,持续7d;噪声+TMX组于出生第18d天给予单次TMX(1.5 mg/10 g)皮下注射,出生第24天开始暴露于100 dB SPL稳态白噪声中,每日连续8h,持续7d;空白组不作处理.分别于实验前(出生第15天)、实验结束后(出生第30天)检测4组小鼠宽带短声(Click)及频率为8、16、32 kHz短声听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)的反应阈;实验结束后处死小鼠,迅速断头取出双侧耳蜗,Western blot法检测Cx26蛋白表达.结果 4组实验前Click及8、16、32 kHz频率短声ABR反应阈比较差异均无统计学意义(P>0.05);噪声+ TMX组实验结束后Click[(42.08±5.42) dB SPL]及8、16、32 kHz频率短声ABR反应阈[(47.08±5.82)、(62.92±9.16)、(84.58±4.98) dB SPL]均高于噪声组[(29.38±4.03)、(40.63±6.80)、(39.06±7.35)、(56.25±12.45) dB SPL]、TMX组[(21.50±5.80)、(28.50土4.74)、(25.50±4.97)、(37.50±7.17) dB SPL]、空白组[(24.58±5.82)、(28.33±6.51)、(29.17±3.59)、(39.17±8.75) dB SPL](P<0.05),且噪声组高于TMX组和空白组(P<0.05),TMX组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05);实验结束后耳蜗Cx26蛋白表达在噪声+TMX组(0.710±0.175)、噪声组(0.774±0.157)、TMX组(0.851±0.087)均低于空白组(1.117±0.114) (P<0.05),噪声+TMX组、噪声组、TMX组耳蜗Cx26蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 降低耳蜗Cx26蛋白表达可增加小鼠对噪声的易感性.
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编辑人员丨2023/8/6
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心肌特异性Hdac3基因缺失引起小鼠心室重构
编辑人员丨2023/8/6
目的 观察在他莫昔芬诱导下,心肌特异性Hdac3基因缺失对小鼠心脏病理结构及其心脏功能的影响.方法 利用Cre/Loxp基因重组系统,将Hdac3loxp/loxp小鼠与Myh6-creERT小鼠进行杂交,获得带有心肌特异性启动子的Myh6-creERT/Hdac3loxp/loxp小鼠,并按随机数字表法将28只8周龄雄性Myh6-creERT/Hdac3loxp/loxp小鼠分为对照组、模型组.模型组小鼠腹腔注射0.2 mL他莫昔芬(40 mg/mL),每天1次,连续5d,从而诱导性敲除心肌特异性Hdac3基因;对照组小鼠注射0.2 mL的玉米油.在模型建立后第1、4周,采用经胸二维超声心动图检测两组小鼠舒张末期室间隔厚度(diastolic interventricular septum,IVSd)、舒张末期左室后壁厚度(diastolic left ventricular posterior wall,LVPWd)、射血分数(ejection fraction,EF)、左室短轴缩短率(fractional shortening,FS).随后获取并观察小鼠心脏组织,采用HE染色、Masson三色染色、天狼星红染色、WGA免疫荧光染色检测小鼠心脏病理改变.采用TUNEL检测心肌细胞凋亡水平,Western blot检测DNA损伤相关指标.结果 Hdac3基因缺失后,与对照组相比,模型组小鼠IVSd与LVPWd明显增高(P<0.05),EF与FS明显降低(P<0.05).病理学观察结果显示,与对照组相比,模型组小鼠于Hdac3基因敲除后第1周,心肌细胞排列紊乱,横断面显示心肌细胞肥大,间质纤维化增多,伴有少量的炎症细胞浸润;第4周可见弥漫的心肌纤维化与肥大不规则的心肌细胞.TUNEL免疫荧光染色显示模型组凋亡细胞较对照组显著增多(P<0.05);Western blot检测结果显示,模型组γH2AX蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05).结论 小鼠心肌特异性Hdac3基因的缺失能够引起DNA损伤并诱导心肌细胞凋亡,导致心肌细胞发生病理性结构改变及心脏功能降低,最终引起心室重构.
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编辑人员丨2023/8/6
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DDR2血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠的复制、鉴定及表型分析
编辑人员丨2023/8/6
目的 应用Cre/LoxP系统复制盘状结构域受体2(DDR2)在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠模型DDR2i?EC(DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2),并分析其在肝脏中的表型.方法 复制DDR2打靶载体,通过电转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)打靶,通过聚合酶链反应(PCR)+脱氧核糖核酸(DNA)印迹法鉴定筛选阳性ES细胞,将阳性的ES细胞注射到C57BL/6N小鼠囊胚,移植入受体小鼠子宫以获得嵌合体小鼠.将得到的嵌合体小鼠与C57BL/6N小鼠回交得到F0杂合子,F0代杂合小鼠自交筛选获得F1代DDR2flox/flox小鼠,该小鼠与Cdh5-Cre/ERT2小鼠杂交,通过子代自交获得DDR2在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除(DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2)小鼠.他莫昔芬诱导血管内皮细胞上DDR2基因敲除,对小鼠进行表型分析.结果 获得DDR2血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠DDR2i?EC(DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2),DDR2i?EC小鼠出生时符合孟德尔遗传定律,发育良好,他莫昔芬诱导敲除小鼠血管内皮细胞DDR2基因表达后,小鼠出现自发性肝纤维化及黄体血管新生障碍等表型.结论 成功复制DDR2血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠模型.血管内皮细胞DDR2缺失能导致自发性肝纤维化.
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编辑人员丨2023/8/6
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活化的肝星状细胞RBP-J可诱导性基因敲除小鼠的构建及应用
编辑人员丨2023/8/5
目的:利用Cre-loxp可诱导系统构建活化的肝星状细胞RBP-J可诱导性基因敲除小鼠模型,以实现肝纤维化过程中活化的肝星状细胞Notch信号通路的特异性阻断.方法:将Sm22αCreERT2和RBP-Jflox/flox转基因小鼠杂交,得到F1小鼠,将繁殖的F1小鼠继续进行交配,得到F2小鼠,通过PCR鉴定出基因型为Sm22αCreERT2,RBP-Jflox/flox的小鼠.通过腹腔注射四氯化碳建立肝纤维化模型,检测四氯化碳注射不同时间段后肝脏纤维化进展情况和肝星状细胞活化过程中Sm22α的表达情况.注射他莫昔芬诱导活化肝星状细胞中RBP-J基因的特异性敲除.分选肝星状细胞,q-PCR和Western Blot检测活化肝星状细胞中Notch下游靶基因Hes1、Hey1表达情况以验证敲除效果.结果:通过连续交配我们获得了Sm22αCreERT22,RBP-Jflox/flox小鼠.四氯化碳腹腔注射4周即可诱导肝脏发生较为明显的纤维化,同时肝星状细胞活化并逐渐高表达Sm22α.给予他莫昔芬诱导Cre重组酶发挥作用后,敲除了活化的肝星状细胞中的RBP-J基因,其下游基因Hes1、Hey1表达降低70%以上,阻断了Notch信号通路.结论:我们成功构建了RBP-J可诱导性条件性基因敲除小鼠模型,实现了小鼠肝纤维化过程中活化肝星状细胞Notch信号通路的阻断,为深入研究Notch信号通路在肝纤维化中的作用和机制奠定了坚实的基础.
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编辑人员丨2023/8/5
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基于CRISPR/Cas9技术电转建立RAW264.7巨噬细胞Mincle敲除株及其对炎症响应的变化研究
编辑人员丨2023/8/5
目的:采用高效基因电转法,通过电转CRISPR/Cas9质粒建立巨噬细胞可诱导性C型凝集素(Mincle)敲除的RAW264.7巨噬细胞系,并探讨Mincle敲除对脂多糖刺激下巨噬细胞炎症的影响.方法:对融合度为80%的RAW264.7巨噬细胞实施px-458-Mincle质粒电转.电转后24 h观察荧光效果,并通过流式细胞分选仪得到荧光阳性细胞,挑选并培养出36个克隆测序,最终鉴定出敲除成功的细胞系.提取RNA检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表达,以及巨噬细胞极性标志物iNOS和CD206的表达.结果:摸索多个NEPA21电转仪对RAW264.7细胞电转条件,结果显示(300 V,5 ms)电转效果最佳,最高转染率高达30.7%.挑选的36个细胞克隆通过测序显示,突变率为58.33%,纯合子突变率为22.22%,敲除成功率为16.67%(缺失碱基数非3的倍数).Western blot和免疫荧光检测验证Mincle蛋白表达缺失,说明敲除成功.与未敲除细胞相比,Mincle敲除细胞在脂多糖(100 ng/ml)刺激下,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表达显著降低(P<0.001),抑制炎症的因子IL-10表达增加(P<0.01),M1型巨噬细胞标志物iNOS表达显著降低(P<0.001),M2型巨噬细胞标志物CD206则大幅增加(P<0.001).结论:高效电转仪NEPA21可用于免疫细胞等难转细胞的转染.Mincle在巨噬细胞中的敲除能显著降低脂多糖刺激的细胞炎症,提示Mincle在巨噬细胞炎症中的重要作用.
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编辑人员丨2023/8/5
