目的:分析中国儿童谷氨酸脱氢酶型先天性高胰岛素血症(GDH-HI)的临床特征及遗传学特征。方法:选取2008年2月至2018年12月间首都医科大学附属北京儿童医院收治并诊断为GDH-HI的10例患儿家系为研究对象，对患儿的临床特征、致病基因携带情况和后期随访等进行回顾性分析。采用聚合酶链反应DNA(PCR-DNA)直接测序法和二代测序技术对10例患儿及其亲属进行GLUD1基因测序分析。结果:10例患儿中9例出生体重正常，1例为巨大儿。9例患儿伴有无症状性高氨血症，1例患儿血氨正常。9例患儿曾试用二氮嗪治疗，均有效。10例患儿均携带GLUD1基因突变，其中5例携带GLUD1基因c.965C>T(p.R322H)突变，其余5例分别携带c.1388A>T(p.N463I)、c.1495C>A(p.G499C)、c.1493C>T(p. S498L)、c.1519G>A(p.H507Y)、c.1388A>G(p.N463S)突变；9例(90%)为新生突变，1例为父系常染色体显性遗传。8例患儿经长期随访，其中1例于确诊8年后自行缓解，7例需长期口服二氮嗪维持正常血糖水平，其中2例合并癫痫。结论:中国GDH-HI患儿出生体重多为正常，少数患儿血氨正常；GLUD1基因突变多为新生突变，其中GDH p．R322H突变为中国儿童GDH-HI的热点突变。GDH-HI患儿多对二氮嗪治疗有效，随着病程的进展，部分患儿可出现癫痫，少数患儿有自行缓解倾向。

目的:探讨抑制星形胶质细胞丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）表达对减轻谷氨酸兴奋性毒性进而发挥神经元保护的作用机制。方法:慢病毒介导MAPK14干扰载体由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，星形胶质细胞从出生48 h的SD大鼠获取，通过慢病毒介导转染体外培养的星形胶质细胞，按照随机数字表法分为三组：（1）未转染组，为正常星形胶质细胞，细胞加入杜氏培养液（DMEM）进行培养；（2）阴性对照组，转染MAPK14空载干扰载体；（3）慢病毒转染组，转染MAPK14干扰载体。转染72 h后星形胶质细胞与神经元共培养48 h，随后构建谷氨酸兴奋性毒性环境作用2 h。检测指标包括：慢病毒载体转染星形胶质细胞最佳转染指数（MOI）；rPCR检测转染72 h后MAPK14和谷氨酸转运蛋白1（GLT-1）mRNA表达水平；Western blot检测转染72 h后MAPK14及GLT-1蛋白表达水平；分光光度法和流式细胞术分别检测谷氨酸兴奋性毒性环境作用2 h后神经元乳酸脱氢酶（LDH）水平和神经元死亡率。结果:（1）慢病毒转染星形胶质细胞最佳MOI值为30，转染后的星形胶质细胞生长良好。（2）转染72 h后，与未转染组（0.013 1±0.001 1）和阴性对照组（0.013 9±0.001 0）比较，慢病毒转染组MAPK14 mRNA表达水平（0.005 7±0.000 6）显著下降（ P<0.01）；与未转染组（0.008 7±0.000 3）和阴性对照组（0.008 9±0.001 1）比较，慢病毒转染组GLT-1 mRNA表达水平（0.009 1±0.001 2）未见明显变化（ P>0.05）。（3）转染72 h后，与未转染组（0.61±0.05）和阴性对照组（0.63±0.01）比较，慢病毒转染组MAPK14蛋白表达水平（0.29±0.04）显著下降（ P<0.01）；与未转染组（0.20±0.03）和阴性对照组（0.23±0.09）比较，慢病毒转染组GLT-1蛋白表达水平（0.73±0.06）显著上升（ P<0.01）。（4）谷氨酸兴奋毒性作用2 h后，慢病毒转染组LDH水平［（109.67±2.40）U/L］较未转染组［（141.52±3.88）U/L］和阴性对照组［（141.29±3.61）U/L］显著降低（ P<0.01），慢病毒转染组神经元死亡率［（38.72±0.26）%］较未转染组［（52.94±1.36）%］和阴性对照组［（54.30±1.23）%］显著降低（ P<0.01）。 结论:慢病毒介导MAPK14干扰载体转染星形胶质细胞后能上调GLT-1表达水平、促进谷氨酸重摄取，从而减轻神经元谷氨酸兴奋性毒性，可为进一步利用星形胶质细胞基因调节减轻创伤性脑损伤后谷氨酸兴奋性毒性神经元损伤提供新的实验依据。

目的:比较特应性皮炎患者与健康对照皮肤样本的单细胞转录组测序数据，探讨特应性皮炎皮损中炎症性树突状表皮细胞（IDEC）的免疫代谢特征。方法:对既往发表的8例特应性皮炎患者和7例健康对照的单细胞测序数据进行深入挖掘，利用标记基因筛选出IDEC，获取两组IDEC的差异表达基因，并对差异表达基因进行京都基因组百科全书富集分析，使用Seurat中的"AddModuleScore"功能对两组IDEC的炎症通路和代谢通路进行评分，Mann-Whitney秩和检验进行统计分析；通过上述评分以及R语言中的"cor"和"cor.test"函数来评估IDEC的代谢通路与炎症通路之间的相关性。结果:特应性皮炎患者皮损中大量浸润的IDEC高表达Th2趋化因子（CCL17）、抗原提呈相关基因（CD1B）、内皮生长相关基因（TYMP、AREG）、炎症相关基因（S100A8、S100A10、LGALS1）、基质纤维化相关基因（MMP12、ADAM19）、代谢相关基因（乳酸脱氢酶、脂肪酶A、谷氨酰胺合成酶）、危险信号传导相关基因（HSPA1B、HSP90AA1、HSPB1、HSPH1）。特应性皮炎患者IDEC的葡萄糖能量代谢、糖酵解代谢、核苷酸代谢、谷氨酸和谷氨酰胺代谢、氨基酸代谢活性显著上调，并且与Th2炎症水平呈正相关；氧化磷酸化和脂代谢活性显著下调，其中脂代谢活性与Th2炎症水平呈负相关。谷氨酰胺代谢和葡萄糖能量代谢活性与Th22炎症水平呈正相关；Th1炎症水平和Th17炎症水平与磷酸戊糖代谢、核苷酸代谢、糖酵解代谢和氨基酸代谢等活性呈负相关。结论:特应性皮炎患者皮损中IDEC的炎症和代谢相关基因调节异常，多条代谢通路显著上调，其中糖酵解代谢活性与Th2炎症水平相关性最强。

目的 采用网络药理学方法探讨水臌贴治疗肝硬化腹水的潜在靶标及作用机制.方法 利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)获取水臌贴中活性成分及其活性成分所对应的药物靶点.通过人类基因综合数据库(GeneCards)、美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库获取肝硬化腹水的疾病靶点.利用韦恩(Venn)在线工具获得水臌贴活性成分和肝硬化腹水的共同作用靶点.运用Cytoscape软件构建水臌贴活性成分与靶点间相互作用网络关系图.应用Webgetal数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库信号通路富集分析.通过文献获得调控铜死亡的靶基因并筛选其与水臌贴活性成分、肝硬化腹水3者的共同靶基因,采用CB-Dock2分子对接技术评估水臌贴活性成分与共同靶基因的结合潜力.结果 从水臌贴中筛选出具有作用靶点的50个有效活性成分,其中关键成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素等,水臌贴调控铜死亡治疗肝硬化腹水的核心作用靶点基因为铁氧还原蛋白1基因(FDX1)、二氢硫辛酸脱氢酶基因(DLD)、谷氨酰胺合成酶基因(GLS)、环粒蛋白激酶抑制剂2A基因(CDKN2A),KEGG分析涉及的信号通路主要为D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、近端小管碳酸氢盐回收等.结论 水臌贴可以靶向铜死亡过程的关键基因构成的网络,发挥治疗肝硬化腹水的系统药理作用.

对1例蓝氏贾第鞭毛虫感染者进行虫种分子鉴定并分析其感染来源.收集患儿与其父母、保姆的新鲜粪样,碘液染色后镜检,提取粪样DNA,采用巢式PCR扩增贾第虫磷酸丙糖异构酶(tpi)、谷氨酸脱氢酶(gdhi)、β-贾第素(bg)基因并测序,通过BLAST、ChromasPro和MEGA 11.0等软件对基因序列进行系统进化分析并判断其集聚体类型.结果显示,镜下可见患儿粪样中有贾第虫滋养体和包囊.巢式PCR均扩增出约500 bp的条带,与贾第虫属tpi、gdh、bg基因片段一致,确认该患儿为贾第虫感染;患儿父母和保姆均无腹泻症状,但在其父亲粪样中发现贾第虫包囊,结合巢式PCR与测序结果分析,其父为贾第虫带虫者.基因比对分析结果显示,患儿父子二人粪样扩增出的tpi、gdh、bg基因序列一致性分别为99.8％、100％和98.5％,其中tpi基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型(GenBank登录号:LC183963)的序列一致性分别为100％、99.8％,gdh基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型(GenBank登录号:KF843931)的序列一致性分别为99.6％、100％,患儿bg基因序列与集聚体AⅢ型(GenBank登录号:LC183968)的序列一致性为99.2％,患儿父亲bg基因序列与集聚体AⅡ型(GenBank登录号:LC183975)的序列一致性为100％.系统进化树分析结果显示,患儿与其父亲所感染的贾第虫均与集聚体A型虫株聚在一支,且以tpi和gdh为靶基因进行亚型分析均与贾第虫集聚体AⅡ型聚在一支.由此判断患儿为贾第虫集聚体AⅡ型感染,且可能为家庭内部传播导致的家庭聚集性感染.

目的 评价3种艰难梭菌感染(CDI)检测方法的诊断效能,为CDI寻找合适的诊断方案.方法 收集中国人民解放军广州总医院2016年5月~12月疑似CDI的腹泻患者粪便标本70例,采用3种方法进行检测:(1)培养法;(2)酶联荧光法检测艰难梭菌毒素A/B(CDAB)和谷氨酸脱氢酶(GDH);(3)q-PCR扩增艰难梭菌特异性基因tpi和毒素基因(tcdA/tcdB).以培养法的检测结果作为参考标准,计算3种方法的诊断指标.结果 收集粪便样本70例,分离艰难梭菌13例(18.57%),其中产毒株6例(8.57%).q-PCR法鉴定tpi基因阳性17例,其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断符合率分别为92.31%、91.23%、70.59%、98.11%、91.43%,均高于GDH法(84.62%、84.21%、55.00%、96.00%、84.29%)(χ2=24.881,P<0.001),且q-PCR扩增tcdA/tcdB的敏感度(66.67%)优于CDAB(33.33%)(χ2=35.918,P<0.001).结论 CDAB检测和q-PCR法特异性较高,GDH法具有较好的灵敏度,3者均有较高的阴性预测值.与其他检测方法相比,q-PCR法检测CDI具有时效性强,灵敏度高,特异性好等优势,适用于临床推广.

谷氨酸脱氢酶可在NAD(P)H辅因子协助下催化α-酮戊二酸和谷氨酸之间的转化,是氮代谢途径的关键酶.基于基因组BLAST分析预测,吸水链霉菌5008(S5008)中SHJG_7666 是谷氨酸脱氢酶的编码基因.本研究在大肠杆菌中对SHJG_7666蛋白进行了异源表达,并对其酶学性质进行了表征.系统发育树及同源建模结构分析显示SHJG_7666 具有保守的谷氨酸、α-酮戊二酸结合域以及经典的GXGXXG二核苷酸结合基序,其活性中心由Lys60,Lys78,Asp120催化功能位点及Ser36,Gly38,Gln119,Asp166,Asn300,Ala330谷氨酸、α-酮戊二酸结合位点组成,属于Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶家族;体外生化实验显示,其催化α-酮戊二酸转化为谷氨酸的最适pH和温度分别为7. 5和37 ℃,对底物α-酮戊二酸Km为(25. 3 ±9. 1 )μmol/L, kcat为(3 ±0. 8)×10 -5s-1.本研究验证了SHJG_7666谷氨酸脱氢酶的催化功能,揭示了其活性中心关键氨基酸残基,为利用蛋白质工程手段对SHJG_7666进行分子设计以提高其催化活力,进一步利用代谢工程手段对宿主氮代谢进行调控奠定了基础.

以颠茄毛状根为试验材料,向培养基中添加酵母提取物(yeast extract,YE),测定颠茄毛状根氮代谢关键酶的活性,各形态氮的含量,次生代谢前体物质含量,次生代谢途径中关键酶基因相对表达量以及主要托品烷类生物碱(tropane alka-loids,TAs)莨菪碱和东莨菪碱的产量,初步探究YE诱导合成颠茄毛状根次生代谢产物的机制.结果表明:较对照组而言,氮代谢关键酶硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性显著升高,谷氨酸脱氢酶(GDH) 活性变化不显著.硝态氮,铵态氮含量显著下降,而可溶性蛋白,游离氨基酸,总氮含量均显著升高.此外,YE处理颠茄毛状根提高了次生代谢途径中的前体氨基酸(鸟氨酸和精氨酸) 的含量以及代谢前体腐胺的含量,3个关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶基因(putrescine N-methyl transferase,pmt) 、托品酮还原酶-Ⅰ基因(tropinone reductase-Ⅰ,trI)和莨菪碱6-β-羟化酶基因(hyoscyamine 6-β-hydrox-ylase,h6h)的相对表达量也呈现不同幅度的上升,最终导致莨菪碱和东莨菪碱产量的增多,在处理16 d后分别是对照组的3. 09,1. 85倍.这说明YE诱导氮代谢关键酶活性升高使氮代谢加速,为次生代谢中含氮化合物的合成提供更多原料,同时通过调控次生代谢途径中关键酶基因的表达,使莨菪碱和东莨菪碱产量提高.

通过脑室注射异亮氨酸,探究短期内异亮氨酸对鳜(Siniperca chuatsi)雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路及氮代谢影响.结果显示:脑室注射异亮氨酸后,(1)促进鳜氨氮排泄;(2)谷氨酸脱氢酶基因(Glutamate dehydrogenase,GDH)、谷草转氨酶基因(Glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)和腺苷酸脱氨酶基因(Adenosine monophosphate deaminase,AMPD)氮代谢基因相对表达量显著性上调(P<0.05);(3)鳜血糖含量在0.5h显著性降低(P<0.05);(4)激活了鳜肝脏mTOR信号通路,促使下游分子核糖体蛋白S6磷酸化(P<0.05).结果表明:异亮氨酸能够激活鳜肝脏mTOR信号通路,介导氨基酸代谢,提高鳜氮代谢基因的转录水平,促使氨氮排泄增多.

为阐明γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和生物节律调控的关系,本文以GABA合成(谷氨酸脱羧酶gad等)和代谢(GABA转氨酶GABA-T/pop2、谷氨酸脱氢酶gdh等)突变体,以拟南芥叶片节律性运动为监测指标,探讨了GABA代谢与叶片节律性运动的关系.结果显示,GABA合成突变体(gad1-3)和双突变体gad1 /gad2中叶片节律性运动的振幅低于野生型,在gad1、gad2和gad1/gad2中叶片运动的振幅变化明显;pop2突变体中,叶片运动的节律性变化的振幅明显低于对照,gdh 1/gdh2突变体中,叶片运动呈现非节律性变化的特点;此外,外源γ-氨基丁酸(1.0 mmol.L-1)不同程度提高拟南芥3种生态型(Col、Ler、Ws)叶片节律性运动的振幅,其中Col生态型和Ws生态型叶片振幅变化明显;在生物钟核心基因突变体toc1、lhy、cca1中,叶片运动呈现非节律性变化模式;但外源GABA的添加能够提高这些突变体叶片节律性运动的振幅或者恢复叶片的节律性.上述结果表明GABA代谢平衡直接和间接影响生物钟节律,外源或内源GABA的合成或代谢突变主要影响到叶片节律性运动的振幅.