目的:探究基因工程病毒rL-RVG对肺腺癌细胞(PC9)的影响及其潜在机制.方法:通过CCK8实验评估细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力.通过蛋白质印迹分析NLRP3、Caspase 1、GSDMD、Asc和IL-1β蛋白表达,免疫荧光染色检测NLRP3的表达.应用Hoechst 33342/PI双染法鉴定细胞焦亡.使用NLRP3抑制剂MCC950预处理验证阻断NLRP3/Caspase1/GSDMD通路对细胞焦亡的影响.结果:rL-RVG处理后,PC9细胞表现出细胞焦亡的形态变化,细胞膨胀、气泡突出、膜破裂和胞质流出胞外.rL-RVG处理可明显抑制PC9细胞增殖,而且抑制效果超过了常规的NDV处理.蛋白质印迹分析显示,在 NDV、rL-RVG 处理组中,NLRP3、Caspase1-p20、GSDMD-NT、Asc 和 IL-1β 蛋白表达显著上调,而在rL-RVG组中,这些上调效应更为显著.免疫荧光染色结果揭示,在rL-RVG组中,NLRP3的表达高于NDV组和Mock组.另外,rL-RVG处理显著减弱了 PC9细胞的迁移和侵袭能力.Hoechst 33342/PI双染显示rL-RVG处理导致PI阳性细胞(红色荧光)显著增加,提示细胞焦亡,其中rL-RVG组效应更为显著.MCC950预处理实验进一步证实,阻断NLRP3/Caspase1/GSDMD信号通路可以减轻rL-RVG诱导的PC9细胞焦亡.结论:rL-RVG通过调控NLRP3/Caspase1/GSDMD通路抑制肺腺癌细胞增殖和诱导焦亡.

目的 探讨重组新城疫病毒(recombinant Newcastle disease virus,rL-RVG)是否通过Nrf2-GCLC-GPX4通路引发胃癌细胞铁死亡.方法 培养人胃癌HGC-27细胞,分别用rL-RVG、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、PBS 溶液(对照组)处理 HGC-27 细胞后,用 CCK-8、Transwell 侵袭、细胞划痕实验检测胃癌HGC-27细胞的增殖、侵袭、迁移能力.加入铁死亡促进剂(erastin)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)促进剂(TBHQ)及抑制剂(ML385)作为干预组,脂质氧化试剂盒检测各组丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;DCFH-DA荧光探针及流式细胞仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;Western blot、免疫荧光法检测 Nrf2-GCLC-GPX4 通路相关蛋白表达情况.结果 与对照组比较,rL-RVG和NDV处理后,细胞的存活率均下降,呈剂量、时间依赖性,且rL-RVG处理组较为显著(P＜0.05);NDV和rL-RVG处理组胃癌HGC-27细胞迁移、侵袭能力均受到抑制,后者较前者抑制更明显(P＜0.05);与对照组比较,病毒组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P＜0.05),MDA水平、ROS相对表达量上升(P＜0.05),rL-RVG组上升或下降的趋势较NDV组明显,且erastin组SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P＜0.05);与对照组比较,TBHQ组、ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P＜0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P＜0.05);与 rL-RVG 组比较,rL-RVG+TBHQ 组、rL-RVG+ML385 组 Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4 蛋白表达分别上升、下降(P＜0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P＜0.05).结论 重组新城疫病毒(rL-RVG)可通过Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡的发生,抑制肿瘤细胞的生长.

[背景]新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的传染可能会引发作为二类传染病之一的新城疫(Newcastle disease,ND),给养禽业带来巨大的经济损失,因而早期、精准的 NDV 筛查是防治 ND 暴发的关键.[目的]针对新城疫病毒(NDV)建立结合 TaqMan 探针的反转录环介导等温扩增技术(RT-TaqMan-LAMP)快速检测方法.[方法]根据NDV F基因序列设计特异性引物组和TaqMan探针,以重组质粒pMD-NDV-F为阳性标准品优化反应条件,验证该方法的特异性、灵敏性和重复性,同时与国家标准(GB/T 16550-2020)中推荐的RT-qPCR方法比较,对 70 份实际样本进行验证.[结果]最佳反应条件为 61℃60 min.引物和探针最优浓度:1.6 μmol/L(FIP/BIP)、0.2 μmol/L(F3/B3)、0.8 μmol/L(LF/LB)、0.2 μmol/L(GTP).最低检测限为 1.651×102 copies/μL,灵敏性是LAMP方法的100倍.无非特异性扩增,与禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)、鸡传染性囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)及疱疹病毒(herpes virus,HSV)均无交叉反应,批次内和批次间变异系数(coefficient of variation,CV)均小于 3%.在 70 份临床样品的检测中本方法比RT-qPCR方法多检测出 1 份阳性样本,经 2 次复测二者的符合率为 98.57%.[结论]本研究建立的NDV RT-TaqMan-LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,并能有效避免非特异性扩增,可用于NDV的精准检测和流行病预防.

目的 探讨表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒rL-RVG抑制人肺腺癌细胞系A549 和PC9 增殖.方法 体外培养人肺腺癌细胞系A549、PC9,将处于对数增殖期的细胞分为对照组、新城疫病毒感染组(NDV)、重组新城疫病毒感染组(rL-RVG)、铁死亡诱导剂组(Erastin)和重组新城疫病毒联合铁死亡诱导剂组(rL-RVG+Erastin).病毒及药物感染细胞 24h后,光学显微镜下观察细胞形态,CCK-8 法检测细胞增殖能力,划痕试验检测细胞迁移能力,细胞毒性检测试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量,Western blot检测铁死亡相关蛋白p53、SLC7A11、GPX4 的表达.结果 与对照组相比,NDV组、rL-RVG组、Erastin组细胞数、细胞增殖能力及迁移的距离明显降低(P均＜0.001),LDH释放量和总ROS水平显著提高(P＜0.01),p53 蛋白表达明显增加(P＜0.001),而SLC7A11、GPX4 蛋白表达明显降低(P＜0.001).rL-RVG组与NDV组相比上述结果更明显(P＜0.05),rL-RVG+Erastin 组与 rL-RVG 组和 Erastin 组相比细胞数、细胞增殖能力及迁移的距离明显减少(P＜0.05),LDH释放量和总ROS水平显著提高(P＜0.05),P53 蛋白表达明显增加(P＜0.001),而SLC7A11、GPX4蛋白表达明显降低(P＜0.001).结论 rL-RVG可以发挥类似Erastin抑制肿瘤细胞增殖的作用,且其效果远远强于NDV.这为rL-RVG诱导的细胞死亡提供了新的见解,并强调了病毒在治疗肿瘤中的关键作用.

目的:探讨表达狂犬病毒糖蛋白(RVG)的重组LaSota株新城疫病毒(recombinant LaSota strain NDV ex-pressing the rabies virus glycoprotein,rL-RVG)是否通过α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)影响胃癌细胞HGC的增殖与凋亡.方法:将rL-RVG、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)和PBS分别感染胃癌HGC细胞24 h后,采用蛋白质印迹法检测RVG、NDV、pro-caspase 3蛋白和α7-nAChR在HGC细胞中的表达,免疫荧光检测α7-nAChR在HGC细胞中的表达,MTT检测HGC细胞的增殖情况.将HGC细胞随机分为rL-RVG组、rL-RVG+α7-nAChR抑制剂组、rL-RVG+α7-nAChR激动剂组,NDV组、NDV+α7-nAChR抑制剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组,PBS组、PBS+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组;倒置显微镜下观察各组细胞形态,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白pro-caspase 3、bax、bcl-2表达水平.结果:蛋白质印迹结果显示,病毒感染HGC细胞24 h后,NDV、pro-caspase 3蛋白和α7-nAChR在rL-RVG组、NDV组的表达均显著高于PBS组(P均<0.01),RVG蛋白在rL-RVG组表达显著高于NDV组和PBS组(P均<0.01);免疫荧光显示α7-nAChR在rL-RVG组中明显高于NDV组和PBS组.MTT结果显示两种病毒浓度大于10-5 mmol/L对细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.05).倒置显微镜下可见NDV+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR抑制剂组HGC细胞分别较NDV组、PBS组皱缩、凋亡更明显,但rL-RVG组与其α7-nAChR抑制剂组相比细胞皱缩、凋亡差异不明显;rL-RVG+α7-nAChR激动剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组HGC细胞皱缩、凋亡分别较rL-RVG组、NDV组、PBS组明显减弱.蛋白质印迹显示bcl-2、bax和pro-caspase 3蛋白在rL-RVG+α7-nAChR抑制剂组的相对表达量与rL-RVG组无显著性差异(P均>0.05),但在NDV+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR抑制剂组的相对表达量分别较NDV组、PBS组显著上调(P均<0.01);rL-RVG+α7-nAChR激动剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组的bax、pro-caspase 3蛋白相对表达量分别较rL-RVG组、NDV组和PBS组明显下调(P均<0.01),bcl-2蛋白相对表达量则明显上调(P均<0.01).结论:rL-RVG感染HGC后稳定表达,可能通过拮抗α7-nAChR途径促进胃癌细胞的凋亡和抑制其增殖.

根据GenBank数据库K亚群禽白血病病毒(Subgroup K avian leukosis virus,ALV-K)特异性抗原gp85的基因序列,设计一组ALV K特异性的引物和探针,并构建阳性重组质粒.在对反应体系进行优化的基础上,建立了ALV-K的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验和重复性试验.结果显示,本方法能对ALV-K进行特异性扩增,而对A亚群、B亚群、J亚群、E亚群禽白血病毒和新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽流感病毒(AIV)等禽病病原未见扩增.该方法最低能够检测到3.4×101拷贝数/μL的阳性质粒,灵敏度是RT-PCR的100倍.应用本方法对人工攻毒ALV-K的SPF鸡各脏器进行病毒定量分析,结果显示,在攻毒鸡体内心、肝、脾、肺、肾等脏器中均能检测到ALV-K,且肝、肾和脾中的病毒含量显著高于心和肺(P＜0.01).

目的 拯救携带IP10基因的重组新城疫病毒(rNDV-IP10).方法 用重组酶将IP10基因插入rNDV质粒,将重组BRN-FL-IP10质粒和辅助质粒共转染稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-7细胞进行病毒拯救.用鸡红细胞检测重组病毒的血凝效价;用NDV及rNDV分别感染鸡胚成纤维细胞,检测病毒的生长动力学;用NDV及rNDV分别感染乳仓鼠肾细胞(BHK-2细胞),间接免疫荧光技术检测IP10蛋白的表达;将rNDV-IP10重组病毒感染人肝癌细胞低转移株(MHCC-97L),Western blotting法检测细胞中IP10蛋白表达.结果 鸡红细胞血凝效价为阳性,重组病毒rNDV-IP10的生长特征与亲本NDV相比相似.感染了rNDV-IP10的BHK-2细胞具有特异性荧光,感染了rNDV-IP10的MHCC-97L细胞具有特异性条带.结论 成功拯救出能够表达IP10基因的重组病毒rNDV-IP10.

副粘病毒 (Paramyxovirus) 包膜上镶嵌着两种糖蛋白血凝素-神经氨酸酶 (Hemagglutinin-neuraminidase, HN) 和融合蛋白 (Fusion protein, F), 两者的相互作用是决定病毒宿主范围、毒力和传播的关键.为探讨HN颈部与F相互作用区 (Fusion interaction region, FIR) 在膜融合机制中的作用, 选取新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV) 与人副流感病毒3型 (human parainfluenza virus type 3, hPIV3) 为研究对象, 通过片段置换及同源重组技术构建嵌合体C1、C2, 进一步将NDV及hPIV3HN的FIR内第51位丝氨酸 (Serine, S) 、第55位天冬氨酸 (Aspartic acid, D) 定点突变为丙氨酸 (Alanine, A), 获得突变体NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A, 对嵌合体及突变体蛋白的细胞表面表达效率、受体识别活性、神经氨酸酶活性、促细胞融合活性及半融合活性进行检测.结果:各嵌合体C1、C2及突变体NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A的细胞表达效率、神经氨酸酶活性 (Neuraminidase, NA) 与野生型相比差异不显著 (P>0.05), 但促细胞融合活性均有不同程度的降低 (P<0.05), C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A分别为野生型的7％、9％、27％、19％、17％和21％;C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A的受体识别活性分别为14.7％、22.3％、35.5％、28.8％、33.9％和40.2％, 与野生型相比差异显著 (P<0.05) .结果表明:副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区的突变及置换使HN蛋白的促细胞融合活性、受体识别活性降低, 其中第51位丝氨酸 (S51) 及第55位天冬氨酸 (D55) 发挥重要作用.

目的:探讨表达IL-29的重组新城疫病毒LoSota株(recombinant Newcastle disease virus LoSota line expressing IL-29,rL-IL29)对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制.方法:体外培养肺腺癌A549细胞,以rL-IL29感染的A549细胞为rL-IL29组,LoSota株新城疫病毒(NDVL)感染的A549细胞为NDVL组及PBS处理的A549细胞为对照组.蛋白质印迹法检测各组A549细胞中NDV HN、IL-29蛋白的表达;CCK8法、划痕试验及Transwell侵袭实验检测rL-IL29对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;蛋白质印迹法检测细胞E-钙黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT/NF-κB通路相关蛋白的表达水平.结果:A549细胞感染rL-IL29后,NDV HN及IL-29蛋白均稳定表达,且明显高于NDVL组及对照组;rL-IL29及NDVL感染A549细胞后能够抑制细胞的增殖、迁移及侵袭,且rL-IL29作用更强;与对照组及NDVL组比较,rL-IL29感染后A549细胞中E-钙黏蛋白表达量明显增加,波形蛋白、MMP2(66 kDa/72 kDa)、p-AKT及P65蛋白表达明显减弱(均P＜0.05).结论:rL-IL29可能通过阻碍AKT/NF-κB信号通路上调E-钙黏蛋白表达和下调波形蛋白、MMP2蛋白表达,从而抑制肺腺癌A549细胞增殖、侵袭及迁移.

目的 探讨重组新城疫病毒rL-IL29对小细胞肺癌细胞系H446细胞内质网应激、自噬及凋亡相关蛋白表达的影响.方法 将H446细胞随机分为对照组、新城疫病毒(NDV)组及rL-IL29组,后2组分别转染NDV和rL-IL29.CCK-8法检测细胞活性;ELISA检测细胞上清中IL-29含量;Western blot和免疫荧光检测内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP的表达.并分别加入内质网应激抑制剂4-PBA预处理4 h,Western blot检测处理组及对照组GRP78、CHOP、自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的表达.结果 感染H446细胞后,随着病毒浓度的升高,细胞活力明显降低,其中rL-IL29在10-5升高明显(P<0.05).rL-IL29处理组细胞上清中IL-29含量明显升高(P<0.05),rL-IL29组IL-29蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05).NDV组、rL-IL29组中GRP78及CHOP表达明显升高(P<0.05),LC3Ⅰ/Ⅱ、cleaved-caspase-3表达明显高于对照组(P<0.01),且rL-IL29组明显高于NDV组(P<0.05).4-PBA预处理后,4-PBA组GRP78、CHOP、cleaved-caspase-3以及LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达明显降低(P<0.05).结论 rL-IL29能促进人小细胞肺癌细胞内质网应激、自噬及凋亡相关蛋白的表达.