釉基质蛋白（enamel matrix proteins，EMP）在牙骨质形成前沉积在发育中的牙根表面，并可能在牙骨质形成中发挥作用，釉原蛋白（amelogenins，Am）是EMP中的主要组分和活性成分。研究显示EMP在牙周组织再生治疗等领域具有重要的应用价值。EMP可通过影响生长因子和炎症因子的表达，作用于各类牙周组织再生相关细胞，发挥促进血管形成、抗炎抑菌和加速组织愈合等功能，从而达到牙周组织再生的临床效果（新生牙骨质、牙槽骨并有牙周膜功能性穿通）。单独使用EMP或EMP联合植骨材料或屏障膜，可用于骨内缺损、上颌颊侧和下颌Ⅱ度根分叉病变的再生性手术治疗；EMP还可以辅助治疗退缩类型为1或2类的牙龈退缩，使暴露的根面重新获得真正的牙周组织再生。随着学界对EMP的牙周再生原理和当前临床应用的全面了解和认识，可进一步展望EMP未来的发展。采用生物工程技术开发重组的人Am以替代动物来源的EMP，研究EMP与其他胶原生物材料的联合应用，以及探讨在重度牙周软硬组织缺损和种植体周病变中EMP的具体应用方式，都是未来EMP相关研究的重要发展方向。

目的:DNATyper17+28Y复合扩增体系包含16个常染色体短串联重复序列(autosomal short tandem repeat，A-STR)、28个Y染色体短串联重复序列(Y-chromosome short tandem repeat，Y-STR)和1个Amelogenin的复合扩增体系，本研究对该体系进行系列法医学验证后评估其性能指标，为实际应用提供参考。方法:本研究从体系灵敏度、种属特异性、混合样本鉴别能力、准确性、重现性、稳定性、耐受性、PCR扩增条件等方面对该体系进行了系统验证。结果:该体系灵敏度高，特异性好，具有良好的准确性、重现性、稳定性和耐受性。结论:DNATyper17+28 Y复合扩增体系的各项性能指标能满足个体识别、亲缘关系分析、家系排查等检验需求，在法医物证中有应用价值。

目的:研究孕期尼古丁暴露对子代小鼠牙釉质形成的影响及其可能的表观遗传学机制。方法:通过随机数字表法将10只C57BL/6孕鼠分为对照组（皮下注射生理盐水）及孕期尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure，PNE）组（皮下注射尼古丁溶液），每组5只，孕鼠生产后分别收集出生后0 d（postnatal day 0，P0；P14、P25含义依此类推）、P14、P25新生小鼠，根据母代分组分为子代对照组及子代PNE组，并记录P0、P25子代小鼠体质量。采用显微CT（micro-CT）扫描分析、扫描电镜和维氏显微硬度检测对子代小鼠牙槽骨和下颌切牙进行硬组织相关参数分析。提取P25子代小鼠下颌骨组织及第3代牙上皮干细胞（dental epithelial stem cell，DESC）中的总RNA，通过实时荧光定量PCR检测成骨向及成釉向分化相关基因、增殖相关标志物和干细胞标志物的表达水平。采用石蜡切片免疫组织化学染色观察增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，Pcna）、釉原蛋白（amelogenin，Amelx）、甲基转移酶ZESTE增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，Ezh2）、组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰（histone H3 trimethylated at lysine 27，H3K27me3）阳性染色分布及水平。使用细胞增殖（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒对外源性添加不同浓度（0.01、0.1、1 mmol/L）尼古丁以及Ezh2抑制剂GSK126的DESC进行细胞活力检测。结果:PNE组孕鼠较对照组更容易出现不良妊娠结局，P0时子代PNE组小鼠体质量［（0.99±0.02）g］显著低于子代对照组［（1.20±0.04）g］（ P<0.001）；P25时，子代PNE组小鼠体质量［（9.65±1.32）g］显著低于子代对照组［（15.26±1.70）g］（ P<0.001），死产率［（46.40±9.30）%］显著高于对照组（0）（ P<0.001）。P14和P25时，子代PNE组小鼠下颌切牙釉质矿化沉积点与第一磨牙近中面的距离数值［分别为（-1 349±45）、（-506±380）μm］均较子代对照组［分别为（-1 192±147）、（504±198）μm］显著减小（ P<0.05， P<0.001），提示矿化沉积点延迟。子代PNE组小鼠切牙釉柱及釉柱间质较对照组排列松散无序，显微硬度［（245.7±18.4）MPa］较子代对照组［（371.9±28.7）MPa］显著降低（ P<0.001）。HE染色显示子代PNE组小鼠前成釉细胞（pre-ameloblast，Pre-Am）区域排列较对照组紊乱，矿化沉积点推迟，暂时性扩增细胞（transit-amplifying cell，TA）及Pre-Am区域延长。免疫组织化学染色显示，子代PNE组小鼠唇侧颈环（labial cervical loop，LaCL）整体Pcna表达较子代对照组显著增多（ P<0.05），H3K27me3较对照组显著富集（ P<0.01），对应区域可见Ezh2表达显著增加（ P<0.01），同时成釉细胞胞质中Amelx阳性信号减弱。体外实验添加1 mmol/L 尼古丁能显著上调子代PNE组DESC的Pcna基因表达水平（ P<0.01），同时显著下调DESC标志物B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1、富亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1和成釉细胞向分化的相关基因Amelx等的基因表达水平（ P<0.05， P<0.05， P<0.01）。此外，与0 h时相比，干预24 h后1 mmol/L尼古丁可显著增强DESC的增殖活性（ P<0.001），添加10 μmol/L Ezh2抑制剂GSK126可挽救1 mmol/L尼古丁对DESC带来的增殖促进作用。 结论:孕期尼古丁暴露可能导致成釉向谱系定向分化过程延迟，致子代小鼠DESC增殖及分化异常，并且影响H3K27me3表观遗传修饰水平，造成子代牙釉质发育障碍，提示孕期尼古丁暴露是牙发育的危险环境因素。

目的:尝试构建永生化的人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFbs)系，并对其功能进行鉴定。方法:标本取自1例2019年11月在北京大学第三医院行耳垂瘢痕疙瘩手术切除的32岁女性患者。将获得的瘢痕疙瘩去除皮下脂肪和表皮，应用组织贴壁法进行分离和培养，获得原代KFbs，以胰蛋白酶消化法进行传代培养；用SV40慢病毒感染原代KFbs，经过嘌呤霉素筛选纯化、传代扩增，获得永生化的人KFb系。对原代KFbs及其细胞系进行染色体核型分析、短串联重复序列(STR)和性别基因检测，来鉴定细胞系身份；采用CCK-8法检测原代KFbs和细胞系增殖能力，并分别用实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测其特定基因(PGK1、ENO1、LDHA、GLUT1、TGF-β1、COL1、COL3、FN)的mRNA和蛋白表达水平。原代KFbs与细胞系间相关数据比较采用 t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:原代KFbs和构建的细胞系的细胞形态均呈典型的长梭形，对细胞系连续培养传代至20代，细胞形态与原代KFbs基本相似。性别基因检测显示两者均为女性，且两者的染色体核型分型良好，仍保留正常细胞的基本特征，而未发生恶性转变。STR鉴定结果显示，细胞系中未发现多等位基因，表明其为正常细胞的基因型，且该细胞系与已知细胞数据库信息均无重合。培养后24、48、72 h细胞系的增殖能力比原代KFbs分别增加了76.1%、125.8%、60.3%，其增殖速度明显较原代KFbs增快( P<0.05)；细胞系中上述特定基因的mRNA及蛋白表达水平与原代KFbs相比无显著改变( P均>0.05)。 结论:成功建立了永生化的人KFbs系，其形态、表征和功能未发生明显改变，且其增殖速度较原代细胞增快。

1 案例1.1 案例资料张某一家三口,父(被检父)、母(被检母)和孩子(男,21 岁)来所办理亲子鉴定委托,在询问了无输血史,不怀疑孩子为自己的近亲属所生,遵循知情同意的原则,采集三人血液数滴制成血痕样本进行亲子鉴定.

牙釉质蛋白基因(Amelogenin)检测是目前国内外最常用的性别鉴定方法,其检测方法简便、灵敏、快捷,在法医物证学实践中具有较高的应用价值,许多商品化试剂盒包含了Amelogenin基因[1].该基因座中Amelogenin-X比Amelogenin-Y小 6 bp,正常男性会在该基因座出现Amelogenin-X和Amelogenin-Y两个峰[2],如果只有Amelogenin-X一个峰经常会被判定为女性,可能是因为Amelogenin基因的变异或片段缺失而造成性别的误判.本文通过对父子在Amelogenin 基因座均只检测出一个Amelogenin-X等位基因的案例进行分析探究,为涉及性别判定的案件和鉴定提供参考.

目的:研究自组装类釉原蛋白两亲性寡肽的骨缺损修复作用.方法:构建具有黏附特性的自组装类釉原蛋白寡肽纳米凝胶、骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞膜片和大鼠股骨骨缺损模型,将SD大鼠随机分为空白对照(Control)组、BMSCs种子细胞膜片(Cell sheet)组、类釉原蛋白寡肽生物支架(OPA scaffold)组、BMSCs种子细胞膜片+类釉原蛋白寡肽生物支架(Cell sheet/OPA scaffold)组,将各组材料填充于股骨骨缺损处,在术后8周分别通过大体观察、微型CT扫描重建及组织学来评估骨缺损修复情况.结果:术后大体标本观察发现4组均有不同程度骨修复,Cell sheet组缺损区大致轮廓仍清晰可见且缺损区仍较深,骨修复最差.与Control组相比,其余两组骨修复较好,以Cell sheet/OPA scaffold组骨缺损区域修复最好,缺损轮廓已不明显.微型CT三维重建及定量分析结果显示,Cell sheet组新骨生成率低于Control组(P＜0.05);OPA scaffold组和Cell sheet/OPA scaffold组新骨生成率优于Control组(P＜0.05),两组缺损区域都有较高的骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、相对骨体积(BV/TV)、连接密度(Conn.D)和较低的骨小梁分离度(Tb.Sp),其中以Cell sheet/OPA scaffold组最高.组织学结果显示,OPA scaffold组和Cell sheet/OPA scaffold组有较多趋向成熟的骨小梁生成,Control组和Cell sheet组有少量趋向成熟的骨小梁生成.结论:自组装类釉原蛋白寡肽纳米凝胶具有很好的成骨能力及骨缺损修复能力,具有作为骨组织工程支架材料的潜力加以进一步研究.

釉原蛋白微损分析方法是一种新的考古人类遗骸性别鉴定方法.最新的研究表明,该方法可以对未成年个体和保存较差的人类遗骸进行可靠的性别鉴定,而中国尚未开展相关研究.为验证和优化基于微损取样的釉原蛋白性别鉴定方法,本文对中国不同地区新石器时代至秦汉时期11个遗址的24个样品进行了研究.结果表明,基于该方法测试的所有样本都获得了可靠的性别信息.同时,本文对该方法的实验步骤和性别判定标准进行了优化:1)根据所获43组实验结果,提出以30个肽段作为排除男性假阴性可能的参考阈值;2)对盐酸溶液中的多肽进行多次提取是增加多肽数目和种类的有效途径,同时不会对样品造成二次破坏;3)数据检索过程中,Oxidation(M)和Deamidation(NQ)三种可变修饰对获得可靠的性别鉴定结果是必要的.

目的 提取人釉原蛋白全长基因并进行克隆.方法 从处于釉质发育阶段的青少年下颌第三磨牙的牙胚中取得细胞总RNA,通过反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction)得到釉原蛋白全长基因,与pMD19-T载体构建质粒后转入大肠杆菌E.coliTop10中扩增克隆.结果 经过超微量分光光度计检测,A260/A280为1.99,A260/A230为2.08,表明提取的总RNA质量较高.对釉原蛋白基因与pMD19-T载体构建的质粒进行测序后比对分析,结果与美国国家生物技术信息中心公布的序列一致,表明获得了釉原蛋白全长基因.扩增釉原蛋白全长基因并进行1％琼脂糖凝胶电泳,可见大小约为570 bp的特异性条带,与预期一致.结论 可以从处于釉质发育阶段的人第三磨牙牙胚中提取人釉原蛋白全长基因,并能通过与pMD19-T载体质粒构建转入E.coliTop10中成功克隆.

目的 应用PowerPlex(R) 21 System试剂盒和AGCU 21+1 STR荧光检测试剂盒作为补充位点试剂盒出现的Amelogenin基因座X片段缺失情况.方法 应用Investigator Argus X-12 Kit试剂盒和Microreader?19X ID System试剂盒扩增并进行毛细管电泳,检测出完整的X基因座分型.结果 2013年3月至2016年12月,共发现4例男性个体出现Amelogenin基因座X片段缺失情况.结论 应用PowerPlex(R) 21 System试剂盒和AGCU21+ 1STR荧光检测试剂盒进行日常法医物证检案时,偶尔发生Amelogenin基因座X片段缺失,利用其他法医物证鉴定试剂盒进行验证可确保正确的基因分型.