目的 为制备具有穿透血脑屏障和血脑肿瘤屏障能力及靶向脑胶质瘤的脂质体载体,合成以靶向肿瘤新生血管的c(RGD)2 肽与脑靶向肽Angiopep-2 共修饰的脂质体,用131 I标记并研究其生物分布特征.方法 将 c(RGD)2 与 Angiopep-2分别与DSPE-PEG2000 偶联,用氢化大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-Angiopep-2 和 DSPE-PEG2000-c(RGD)2 按摩尔比为 60∶34∶3∶3制备脂质体,采用氯胺T法进行131 I标记,测定131 I标记的c(RGD)2 与 Angiopep-2 共修饰的脂质体在小鼠体内的生物分布.结果 所合成的 DSPE-PEG2000-Angiopep-2 与 DSPE-PEG2000-c(RGD)2 经质谱测定的分子量与理论值相符;c(RGD)2 与Angiopep-2 共修饰的脂质体的平均粒径为 143.2±13.8nm,多分散系数(PDI)为 0.214±0.039,Zeta电位为-13.00±1.95;131 I标记率为 87.57%±3.00%,经分离纯化后放射化学纯度为 90.98%±1.69%;131 I 标记的 c(RGD)2 与Angiopep-2 共修饰的脂质体在小鼠肝、脾、胃、肾有较高的摄取,尾静脉注射后 1h与 3h脑摄取率分别为(0.08±0.02)%ID/g与(0.13±0.03)%ID/g.结论 成功制备了一种新型的以Angiopep-2 和c(RGD)2 修饰的脂质体,并探讨了其生物分布特征.其对脑胶质瘤的体内靶向作用有待于进一步研究.

目的 以聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)接枝的介孔二氧化硅纳米粒(mesporous silica nanoparticles,MSN)为核(PAA-MSN),采用薄膜水化法自组装形成Angiopep-2(氨基酸残基序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)修饰的功能化MSN脂质囊纳米粒(ANG-LP-PAA-MSN).通过Angiopep-2与血脑屏障(blood brain barrier,BBB)和脑胶质瘤细胞上高表达的低密度脂蛋白相关受体1(LRP-1)特异性地识别、结合,旨在增加水溶性药物三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)跨血脑屏障并靶向脑胶质瘤能力.方法 采用透射电子显微镜(TEM)、热重分析仪(TGA)等考察递药系统的理化性质和载药量,透析袋法考察其不同pH (pH 6.0、7.4)环境下的释药特征;噻唑蓝(MTr)比色法考察递药系统对人脑微毛细血管内皮细胞(HBMEC)和脑胶质瘤细胞(C6)毒性;通过构建体外BBB细胞模型研究载体对As2O3跨膜转运能力的影响.结果 该载药纳米粒(ANG-LP-PAA-MSN@As2O3)呈圆整的“核-壳”结构,分散性与稳定性良好,载药量为6.32％;PAA接枝后的递药系统突释现象显著改善并表现出pH响应特性;脂质囊包裹以后的递药系统显著提高了生物安全性,同时增加了药物的跨BBB转运率;体外抗肿瘤活性结果表明ANG-PAA-LP-MSN@As2O3具有较好的体外抗脑胶质瘤效果.结论 该智能靶向递药系统能够有效增加As2O3跨BBB转运,增加药物在脑胶质瘤部位的聚集,并实现肿瘤部位pH响应释放药物.

目的构建angiopep-2修饰的硫辛酸-聚精氨酸组氨酸(LHRss)多肽纳米胶束并包载抗肿瘤药物多柔比星(DOX)的脑胶质瘤靶向纳米给药系统(LHRss-An/DOX).方法采用超声乳化法制备包载化疗药物DOX的多肽胶束LHRss-An/DOX,检测复合物的粒径、zeta电位和外观形态;测定载药量和包封率,并对其体外释放特性进行考察;通过体外血脑屏障(BBB)模型考察载药胶束的跨膜转运效率,使用激光扫描共聚焦显微镜观察DOX胞内的分布情况及对脑胶质瘤的靶向性.结果胶束LHRss-An/DOX呈球形,平均粒径为(100.9±8.7)nm,聚合物分散性指数为0.232,电位为(28.8±3.3)mV,最佳药载比为40％,载药量为15.8％,包封率为55.3％,在pH 7.4、pH 5.5和pH 5.5+10 mmol/L DL-二硫苏糖醇(DTT)环境下72 h内的累积释放率分别为(60.3±2.6)％、(84.1±3.9)％和(96.6±2.7)％;LHRss-An/DOX的跨BBB效率分别是LHRss/DOX和游离DOX的2.04和4.27倍,差异有统计学意义(P<0.05);脑胶质瘤细胞U251摄取LHRss-An/DOX的荧光强度强于LHRss/DOX和游离DOX的荧光强度.结论经过angiopep-2修饰的载药纳米胶束的跨BBB能力及脑胶质瘤的靶向性显著增强,是一种潜在高效的靶向胶质瘤给药系统.

目的 制备Angiopep-2(ANG)修饰的载神经毒素(neurotoxin, NT)介孔二氧化硅脂质囊纳米粒(mesoporous silica nanoparticles, MSN)(ANG-LP-MSN-NT),并进行体内外评价.方法 利用改进的Stober法制备介孔二氧化硅纳米粒,然后运用薄膜水化法制备ANG-LP-MSN-NT.考察其形态、粒径、Zeta电位、载药量和包封率;通过小角粉末衍射、氮气吸-脱附法等技术对其进行表征;透析袋法考察其体外释药特性;热板法和醋酸扭体法考察其镇痛效果.结果 制备的 MSN比表面积为557 m·g-1,孔径和孔容积(Vp)分别为2.94 nm和0.58 cm3·g-1.ANG-LP-MSN-NT分布均一,无团聚现象,粒径为(123.37士3.76) nm (PDI 0.20±0.02), Zeta 电位为(-16.57±1.59)mV,载药量与包封率分别为(10.75±0.54)％与 (91,82±3.12)％.ANG-LP-MSN-NT较MSN-NT体外突释降低,缓释特性明显;药效学实验结果表明ANG-LP-MSN-NT起效快、最大镇痛效应优于其他组别.结论 ANG-LP-MSN-NT解决了二氧化硅易团聚、易突释的问题,且更有利于NT在脑部富集,发挥更好的镇痛效果,该纳米递药系统作为神经毒素载体在镇痛方面具有较好的应用前景.

目的 在A型肉毒毒素轻链多肽抑制剂CPI-1引入穿膜序列,提高其抑制活性.方法 基于CPI-1序列,在N端或C端增加穿膜序列Angiopep-2 (Ang)或多聚精氨酸(R8),固相合成线性肽,空气氧化折叠形成目标产物,经RP-HPLC纯化得纯肽.表达A型肉毒毒素轻链截短体LC424,合成含荧光基团与淬灭基团的肉毒毒素轻链水解底物SNAPtide,采用荧光共振能量转移法(FRET)测定各多肽对内毒毒素轻链的抑制活性,小鼠攻毒测定各肽体内活性.结果 将Ang连接于CPI-1的N端或C端后,Ang-CPI-1、Ang-GG-CPI-1、CPI-1-Ang以及CPI-1-GG-Ang的IC50值分别为148.2、251.9、88.1、90.9 nmol/L,相比于CPI-1 (IC50 =411.9 nmol/L)活性提升1～3倍;多聚精氨酸接入CPI-1的N端后导致抑制活性丧失.结论 在CPI-1的N端和C端增加Ang肽能提升其对A型肉毒毒素轻链抑制活性,但不能增加体内活性.

目的 构建Angiopep-2修饰脂质体,并对其理化性质和跨血脑屏障能力进行评价.方法 采用薄膜分散法制备Angiopep-2修饰脂质体(AP-LP),研究其理化特征.原代培养脑毛细血管内皮细胞(BCEC),通过定量细胞摄取实验研究BCEC对AP-LP脂质体的摄取率.复制体外模型,观察不同修饰的AP-LP穿过血脑屏障的能力.结果 制备的AP-LP粒径为(125.0±15.5)nm,Zeta电位为(8.35±3.64)mV.BCEC对AP-LP脂质体的摄取率是普通脂质体的4.1倍,差异有统计学意义(P<0.05);AP-LP的透过血脑屏障能力是普通脂质体的3.6倍,两者比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 AP-LP制备方法简便易行,Angiopep-2修饰脂质体后,脂质体的血脑屏障穿透力增加,靶向性增加,是一种潜在高效的脑部靶向给药系统.

目的 探讨胶质瘤靶向嵌段共聚物胶束(ANPs/CPT)体内外MRI的效果.方法 构建ANPs/CPT,以1/T1对Gd3+浓度作图拟合直线的斜率比较ANPs/CPT和二乙烯三胺五乙酸钆(DOTA-Gd)的纵向弛豫参数r1;将不同浓度的DOTA-Gd、非靶向嵌段共聚物胶束(NPs/CPT)、靶向嵌段共聚物胶束(ANPs/CPT)与C6细胞共培养,采用电感耦合等离子体发射谱(ICP-AES)分析细胞内Gd3+元素含量;采用1.5 T MR分别测量不同含Gd3+制剂MR信号强度(SI)、对比噪声比(CNR);考察ANPs/CPT在正常大鼠脑、心、肝、肾等器官的对比噪声比(CNR);采用胶质瘤大鼠模型观察ANPs/CPT在胶质瘤内的强化特征,计算肿瘤和正常脑组织信号比(T/N)及CNR.不同处理组间不同浓度Gd3+摄入,C6细胞的SI、CNR,正常大鼠各器官的CNR,胶质瘤大鼠不同时间点上3组间T/N、CNR的比较采用单因素方差分析,差异有统计学意义后两两比较采用SNK法.结果 MR弛豫实验显示ANPs/CPT弛豫效率(13.900 s-1·mmol·L-1)约为DOTA-Gd(4.927 s-1·mmol·L-1)的3倍;C6细胞不同浓度Gd3+摄入测定结果显示各组差异具有统计学意义(F值分别为362.502、1636.136、386.880、918.173,P值均<0.001),各组SI和CNR的差异也具有统计学意义(F值分别为55.240、155.419,P值均<0.001).正常大鼠尾静脉注射ANPs/CPT后显示脑组织的CNR在各个时间点与其他器官的差异具有统计学意义(F分别为9.417、21.808、21.383、107.318、178.762、P值均<0.01);胶质瘤大鼠模型注射ANPs/CPT组各时间点T/N(30 min后)、CNR与其余两组比较差异均有统计学意义(F值分别为5.349、6.594、24.078、18.508和6.840、6.780、5.895、12.620、37.139、368.893,P值均<0.05),两两比较差异也均有统计学意义(P值均<0.05).结论 ANPs/CPT具有良好的T1弛豫、长循环、胶质瘤靶向MRI的性能,为下一步研究胶质瘤可视化治疗提供了依据.

目的:设计脑胶质瘤靶向的Ag2S量子点及Ag2S-PEG量子点近红外二区成像探针,并比较修饰脑靶向肽Angiopep-2(ANG)前、后量子点通过体外血脑屏障及靶向脑胶质瘤细胞的能力.方法:Ag2S量子点及Ag2S-PEG量子点和脑靶向肽ANG经EDC和NHS介导,发生氨基和羧基的缩合反应进行连接.对Ag2S、Ag2S-ANG、Ag2S-PEG、Ag2S-PEG-ANG量子点的结构及粒径进行琼脂糖电泳、动态光散射及透射电镜等表征,并评价其对U87 MG和bEnd.3细胞的细胞毒性以及穿透体外血脑屏障的能力.结果:修饰ANG肽后的Ag2S-ANG、Ag2S-PEG-ANG量子点水合粒径较Ag2S、Ag2S-PEG增大,差异有统计学意义(P<0.05);表面Zeta电位正电性增强;在琼脂糖电泳中迁移距离变短.MTT实验发现,Ag2S、Ag2S-ANG、Ag2S-PEG、Ag2S-PEG-ANG四种量子点在100μg/mL以下对U87 MG和bEnd.3细胞的存活率没有影响.在体外血脑屏障模型中,Ag2S-ANG、Ag2S-PEG和Ag2S-PEG-ANG均能够穿过上层的bEnd.3细胞到达下层培养基中,而Ag2S-ANG被下层的U87 MG细胞摄取的量有较大提升,约是Ag2S量子点的6倍,差异有统计学意义(P<0.01).结论:本研究成功构建了2种脑靶向硫化银量子点,其中Ag2S-ANG能够跨体外血脑屏障系统,靶向脑胶质瘤细胞,为进一步的体内脑靶向成像奠定了基础.

为制备angiopep-2修饰的载异硫氰酸荧光素(FITC)标记的神经毒素纳米粒(ANG-NPs/FITC-NT),该实验以一定比例mPEG-PLA和ANG-PEG-PLA为载体,以异硫氰酸荧光素标记的神经毒素(FITC-NT)为药物,采用复乳/溶剂挥发法制备纳米粒.以粒径和包封率为综合指标,考察不同超声功率和超声时间组合对工艺的影响;采用透析法研究其在PBS缓冲液(pH 7.4,6.5)中的体外释药特性.结果 表明制备的ANG-NPs/FITC-NT,最佳工艺为超声功率90 W、超声时间30 s;透射电镜下可见纳米粒外形良好,平均粒径(123.9±0.5)nm,Zeta电位(-10.5±0.5)mV,包封率(68.1±0.4)％,载药量(0.82±0.01)％;在PBS缓冲液(pH 7.4,6.5)中的体外释药行为均符合Ritger-Peppas方程,分别为lnQ=0.5088lnt-2.2850,r=0.9615(pH 7.4)及lnQ=0.4499lnt-1.8553,r=0.9703(pH 6.5).实验结果证明复乳/溶剂挥发法制备的纳米粒,包封率较高,粒径均匀,具有体外缓释特性,可能会成为NT脑内递药的良好载体.

目的 研究靶向低密度脂蛋白受体蛋白1(LRP1)的载药嵌段共聚物(ANPs/CPT)对胶质瘤细胞的增殖抑制和促进凋亡的作用.方法 采用Western blotting技术检测LRP1在大鼠胶质瘤细胞(C6细胞)和脑毛细血管内皮细胞(BCECs)的表达水平.用激光共聚焦显微镜测定C6细胞和BCECs对Angiopep-2修饰的靶向未载药嵌段共聚物(ANPs)和非靶向对照NPs的摄取量;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测ANPs/CPT抑制C6细胞和BCECs增殖的作用;采用流式细胞仪分析不同CPT终浓度(10μg/mL,20 μg/mL)的ANPs/CPT促C6细胞凋亡作用.结果 LRP1在C6和BCECs细胞膜表面高表达.C6细胞对ANPs的摄取量显著高于NPs(P ＜0.01);ANPs/CPT对C6细胞的增殖抑制作用显著高于NPs/CPT(P ＜0.05),但对BCECs的增殖抑制作用与NPs/CPT无显著差异(P＞0.05).CPT终浓度10 μg/mL、20 μg/mL的ANPs/CPT与NPs/CPT作用于C6细胞48 h后的凋亡率分别为(16.1 ±0.9)％、(30.4±1.1)％和(18.8±0.9)％、(40.3±1.2)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 ANPs/CPT有显著的靶向抑制胶质瘤细胞增殖及促进其凋亡的作用,具有潜在的治疗胶质瘤的应用价值.