传统的免疫共沉淀测序（ChIP-seq）是研究蛋白-染色质相互作用的主流方法，由于ChIP-seq难以在低起始细胞量和单细胞样本上实施限制了其应用范围。近年来新发展起来的染色质酶切测序技术CUT&RUN和CUT&Tag展现出操作简单，背景低，可重复性高和要求的细胞起始量低等优点，有替代ChIP-seq进行蛋白-染色质相互作用研究的潜力，并有效提高了单细胞ChIP-seq的可行性。本文将就这类靶向染色质进行酶切测序的主要技术的发展和应用现状做简要综述。

目的 探讨BTB与CNC同源蛋白1(BACH1)通过调节MYC相关因子X二聚化蛋白1(MXD1)基因对套细胞淋巴瘤(MCL)发生发展的影响.方法 采用靶向剪切及转座酶技术(CUT&Tag)检测BACH1下游靶基因,并通过序列比对分析寻找BACH1与MXD1的结合位点.通过双荧光素酶报告基因系统验证BACH1对MXD1的调控作用,并采用慢病毒技术构建BACH1过表达及敲低的稳转MCL细胞株,采用蛋白质印迹法(West-ern blot)检测MXD1蛋白表达水平.应用GSE16411数据集分析MCL细胞和正常B细胞中MXD1 mRNA相对表达量.应用GSE132929及GSE21452数据集筛选MXD1共表达基因,对MXD1共表达基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析.采用噻唑蓝(MTT)法检测MXD1正相关基因应激诱导磷蛋白1同源物含U-框蛋白1(STUB1)的特异性激活剂YL109处理后MCL细胞的活力.结果 BACH1能够靶向结合MXD1并抑制MXD1基因的启动子活性.BACH1敲低后MXD1蛋白表达水平升高,而BACH1过表达后MXD1蛋白表达水平降低.通过GSE16411数据集分析发现,MCL细胞中MXD1 mRNA相对表达量明显低于正常B细胞,差异有统计学意义(P﹤0.01).在GSE132929数据集中筛选出2222个MXD1共表达基因,在GSE21452数据集中筛选出503个MXD1共表达基因.GO分析显示,MXD1共表达基因主要富集于信号转导、蛋白质磷酸化、细胞葡萄糖醛酸化、类黄酮葡萄糖醛酸化等代谢相关的生物学过程;KEGG信号通路分析显示,MXD1共表达基因主要富集于肝脏发育的代谢途径、蛋白质的消化和吸收、Janus激酶(JAK)/信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路等.采用YL109处理MCL细胞后可显著降低细胞存活率.结论 BACH1通过结合MXD1近端启动子负向调控MXD1的表达水平,且BACH1介导的MXD1表达改变很可能通过调控代谢过程参与MCL的发生发展.

目的 绘制胃黏膜高级别上皮内瘤变(High-Grade Intraepithelial Neoplasia,HGIN)组织的组蛋白H3K27me3沉默子图谱,寻找沉默子调控的重要靶基因.方法 从本院内镜中心收集HGIN与正常胃黏膜组织各24例,采用H3K27me3染色体靶向切割和标签化(Cleavage Under Target&Tagmentation,CUT&Tag)测序技术捕获基因组修饰区域.通过生物信息学分析比较两类组织的沉默子信号特征以及差异;整合RNA测序数据及高通量染色体构象捕获技术(Hi-C)公共数据,分析沉默子重塑调控的靶基因及调控的潜在生物学过程.结果 与正常胃黏膜相比,HGIN组织H3K27me3修饰数量减少,信号强度全局性降低,呈现H3K27me3信号峰重塑现象;转录组差异分析结果显示,与正常胃黏膜组织相比,HGIN共有8887个差异表达基因,其中表达上调基因4335个,表达下调基因4552个,其中CTNNB1等肿瘤发生相关基因显著上调;整合分析表观组学和转录组学数据,发现沉默子丢失可能在转录水平上调氨基酸生物合成、精氨酸与脯氨酸代谢和糖酵解等关键代谢基因,如糖酵解关键酶磷酸甘油醛激酶1(phosphoglycerate kinase1,PGK1)表达,进而促进胃黏膜上皮内瘤变.结论 组蛋白H3K27me3沉默子信号丢失是HGIN表观重塑特征之一,沉默子丢失可能与PGK1等糖酵解和氨基酸代谢基因表达紊乱相关.

背景:前期研究成功构建过表达促红细胞生成素的脐带间充质干细胞(erythropoietin-overexpressed umbilical cord mesenchymal stem cells,EPO-MSCs),发现其可以显著减少缺血缺氧人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞的凋亡.目的:探究EPO-MSCs对缺血缺氧SH-SY5Y细胞可能的神经保护机制及其相关表观遗传学机制.方法:用氧-葡萄糖剥夺法缺血缺氧诱导SH-SY5Y细胞损伤,分别与慢病毒转染空载质粒的脐带间充质干细胞(NC-MSCs)、EPO-MSCs共培养后进行转录组测序,根据组间差异基因进行相关分析.同时应用多因子法检测缺血缺氧性脑病患者和对照组脑脊液上清及共培养细胞上清炎性因子表达水平.蛋白组学检测NC-MSCs、EPO-MSCs差异表达蛋白.应用染色体靶向切割和标签化(CUT&Tag)测序技术检测基因组H3K4me2修饰情况,并与转录组测序联合分析.慢病毒载体感染构建稳定敲低REST的SH-SY5Y细胞,应用qRT-PCR、Western blot检测REST的表达水平,然后再缺血缺氧处理并与EPO-MSCs共培养,流式细胞仪检测细胞凋亡情况、Western blot检测H3K36me3组蛋白的表达差异,然后进行转录组测序分析差异表达基因.结果与结论:①与对照组比较,缺血缺氧性脑病患者脑脊液上清中单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、白细胞介素18、白细胞介素1β、干扰素α2、白细胞介素23水平显著增加(P<0.01);②缺血缺氧SH-SY5Y细胞与EPO-MSCs共培养后单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6表达水平明显降低;③蛋白质网络相互作用分析发现单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6相关调控蛋白CXCL1、BGN等显著下调;④转录组测序分析发现EPO-MSCs组SH-SY5Y细胞中促炎基因较NC-MSCs组显著下调,组蛋白修饰的功能富集以及转录因子REST、TET3的表达显著上调;⑤转录组测序与CUT&Tag联合分析发现表观遗传水平变化以及转录因子REST和TET3启动子区域显著激活;⑥成功构建稳定敲低REST的SH-SY5Y细胞,REST mRNA 转录水平和蛋白表达均降低;⑦缺血缺氧处理敲低REST的SH-SY5Y细胞与EPO-MSCs共培养后细胞凋亡显著增加、H3K36me3表达显著降低,转录组测序显示炎性相关基因Aldh1l2、Cth等以及凋亡抑制基因Mapk8ip1、Sod2在mRNA 转录水平表达降低(P<0.01);⑧结果表明:EPO-MSCs通过分泌组的改变影响H3K4me2的峰度从而激活REST、TET3的表达,上调H3K36me3的修饰水平,进而调控炎性相关基因Aldh1l2、Cth等以及凋亡抑制基因Mapk8ip1、Sod2的表达,促进神经元的存活.

在转录延伸过程中,P-TEFb激酶(由激酶CDK9 和Cyclin T1 组成的二聚体)是释放停滞的Pol Ⅱ这一步的关键调节因子.在人类细胞中,它可参与形成三个更大的复合体,即超级延伸复合体(super elongation complex,SEC)、BRD4/P-TEFb 和 7SK snRNP,其活性在前两者中不被抑制,而在后者中被抑制.除 P-TEFb 外,SEC还含有AFF1 或 4、AF9 或ENL、ELL1、2 或 3,EAF1 或 2 等无酶活亚基,这些亚基被认为可通过P-TEFb影响转录延伸.本课题组前期的研究和其他实验室的研究工作均已表明AFF1、AF9 和ENL亚基均可调控转录启始,但尚不清楚 AFF4 是否具有相似的功能.在调控基因表达的选择性方面,近期有研究表明 BRD4/P-TEFb在人类结直肠腺癌细胞DLD-1 中主要负责除热激基因以外的其他基因的停滞释放,而SEC负责热激基因的停滞释放.为了深入理解AFF4 的功能,本研究利用RNA干扰技术在人类红系白血病细胞HEL中敲低了AFF4,发现RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)的羧基端重复区(C-terminal domain,CTD)内第二个丝氨酸(Serine 2,Ser-2)的磷酸化水平降低.利用RNA-seq和CUT&Tag确定了AFF4 的直接靶基因,利用ChIP-seq和PRO-seq发现AFF4 对转录启始的影响不明确、对Pol Ⅱ的停滞释放的调控不局限于热激基因,利用ChIP-qPCR发现AFF4 缺失降低了P-TEFb的染色质结合.上述研究结果表明,AFF4 对Pol Ⅱ的停滞释放的调控可能具有一定的细胞类型特异性,即在一些细胞内仅调控热激基因的停滞释放,而在另一些细胞中调控的对象却不仅限于热激基因.

Mouse dental papilla cells(mDPCs)are cranial neural crest-derived dental mesenchymal cells that give rise to dentin-secreting odontoblasts after the bell stage during odontogenesis.The odontoblastic differentia-tion of mDPCs is spatiotemporally regulated by transcription factors(TFs).Our previous work reveals that chromatin accessibility was correlated with the occupation of the basic leucine zipper TF family during odontoblastic differentiation.However,the detailed mechanism by which TFs regulate the initiation of odontoblastic differentiation remains elusive.Here,we report that phosphorylation of ATF2(p-ATF2)is particularly increased during odontoblastic differentiation in vivo and in vitro.ATAC-seq and p-ATF2 CUT&Tag experiments further demonstrate a high correlation between p-ATF2 localization and increased chromatin accessibility of regions near mineralization-related genes.Knockdown of Atf2 inhibits the odontoblastic differentiation of mDPCs,while overexpression of p-ATF2 promotes odontoblastic differen-tiation.ATAC-seq after overexpression of p-ATF2 reveals that p-ATF2 increases the chromatin accessibility of regions adjacent to genes associated with matrix mineralization.Furthermore,we find that p-ATF2 physically interacts with and promotes H2BK12 acetylation.Taken together,our findings reveal a mech-anism that p-ATF2 promotes odontoblastic differentiation at initiation via remodeling chromatin accessibility and emphasize the role of the phosphoswitch model of TFs in cell fate transitions.

This study aimed to evaluate the therapeutic potential of inhibiting protein arginine methyltransferase 5(PRMT5)in cisplatin-induced hearing loss.The effects of PRMT5 inhibition on cisplatin-induced auditory injury were determined using immunohistochemistry,apoptosis assays,and auditory brainstem response.The mechanism of PRMT5 inhibition on hair cell survival was assessed using RNA-seq and Cleavage Under Targets and Tagment-quantitative polymerase chain reaction(CUT&Tag-qPCR)analyses in the HEI-OC1 cell line.Pharmacological inhibition of PRMT5 significantly alleviated cisplatin-induced damage to hair cells and spiral ganglion neurons in the cochlea and decreased apoptosis by protecting mitochondrial function and preventing the accumulation of reactive oxygen species.CUT&Tag-qPCR analysis demonstrated that inhibition of PRMT5 in HEI-OC1 cells reduced the accumulation of H4R3me2s/H3R8me2s marks at the promoter region of the Pik3ca gene,thus activating the expression of Pik3ca.These findings suggest that PRMT5 inhibitors have strong potential as agents against cisplatin-induced ototoxicity and can lay the foundation for further research on treatment strategies of hearing loss.

新兴的染色质靶向切割和标签化(clevage under target and tagment,CUT&Tag)技术利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下的DNA片段进行标签化,通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质-DNA相互作用,极大的简化了染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)的实验过程.CUT&Tag中转座酶完成标签化后需要DNA回收或其他后处理才能进行建库PCR,不同的回收方法对CUT&Tag结果有着显著的影响.通过建立生物素化转座体-链霉亲和素磁珠体系(streptavidin beads recovery CUT&Tag,srCUT&Tag),可以快速便捷地完成CUT&Tag的产物回收.本文在K562细胞中展开H3K4me3、RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPII)、转录因子CTCF和HMGA1的CUT&Tag实验,并利用现有的乙醇沉淀、片段分选(solid-phase reversible immobilization,SPRI)磁珠回收和直接PCR法,以及本研究建立的srCUT&Tag方法对产物进行回收.结果表明,从整体上看,SPRI磁珠回收和srCUT&Tag方法着较高的回收效率,而乙醇沉淀法则回收效率低下.在全部4种CUT&Tag产物回收过程中,SPRI磁珠回收均会损失大部分小于150 bp的产物片段.在CTCF和HMGA1 CUT&Tag产物的回收中,直接PCR法则损失了大部分大于300 bp的片段并与其他回收方法的结果有较大的差别.因此,srCUT&Tag能够比其他三种回收方法提供更多更完整的测序信息.综上所述,新建立srCUT&Tag回收方法相比现有的CUT&Tag产物回收方法能提高建库效率并得到更好的数据质量,为表观遗传学研究提供了更好的技术选择.

染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是研究目的蛋白与 DNA相互作用的重要方法,被广泛应用于转录因子、组蛋白修饰等分布与功能的研究.研究人员通过对细胞分离、染色质片段化以及测序文库构建等关键步骤不断优化,使ChIP-seq适合少量细胞的分析.近年来发展迅速的CUT&RUN(cleavage under targets and release using nuclease)、CUT&Tag(cleavage under targets and tagmentation)技术,利用特异性抗体使酶"靶向"结合目标蛋白,通过MNase酶切或Tn5转座酶切割染色质,简化了实验操作流程.本文介绍了 ChIP-seq的原理及其数据分析方法,比较ChIP-seq优化方法和衍生技术.总结了在植物生长发育过程中,转录因子和组蛋白修饰在生物钟调控、激素信号转导、光信号途径、胁迫响应等方面研究与染色质免疫共沉淀测序技术的应用.

人类 β-地中海贫血的发病机制与 β-样珠蛋白基因异常表达息息相关.人类 β-样珠蛋白基因以5'-ε-Gγ-Aγ-δ-β-3'的顺序排列于β-珠蛋白基因座,受5'LCR(locus control region)中5个超敏位点(hypersensitive site,HS)5'HS5～5'HS1和3'HS1调控.其中5'HS2是最重要的增强子,能产生增强子RNA(enhancer RNA)并调控ε-globin、γ-globin和β-globin的表达.为了进一步探究K562细胞中增强子5'HS2的功能,本研究首先通过染色质构象捕获技术在人慢性髓原白血病K562细胞中探测到5'HS2介导的染色质相互作用集中在以包含CTCF(CCCTC-binding factor)位点的3'HS1和5'HS5为边界的拓扑结构域中,5'HS2在三维空间上与HBE1、HBG2和HBG1启动子区域相互靠近.其次运用CRISPR DNA片段编辑技术在K562细胞系中删除了增强子5'HS2.最后通过RNA-seq和CUT&Tag(cleavage under target&tagmentation)实验分析两个5'HS2删除的单克隆细胞系的转录组和染色质H3K27ac组蛋白修饰,发现91个基因表达显著下调而且其启动子区的H3K27ac修饰程度显著降低.这些基因主要聚类于氧气运输、免疫应答、细胞粘附、抗氧化和维持血栓形成等与红细胞功能相关的生物过程中,表明K562细胞系中增强子5'HS2对红细胞功能相关基因的转录产生了广泛影响.