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抗B组柯萨奇病毒3型3C蛋白多克隆抗体的制备及初步应用
编辑人员丨6天前
目的:制备抗B组柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB)3C蛋白的多克隆抗体。方法:通过聚合酶链式反应从pcDNA3.1(+)-EGFP-3C中扩增编码3C的DNA片段,构建pET28a(+)-3C-6His表达载体,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli, E. Coli)BL21(DE3)以表达3C重组蛋白。优化表达条件及菌体蛋白的提取方法,经超声破碎制备菌体总蛋白,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,用氯化钾进行胶染色,切胶回收相对分子质量为26 000的蛋白,即纯化的3C重组蛋白(3C-6His的相对分子质量为26 000)。用纯化的1 mg 3C重组蛋白加等量弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,共免疫5次,每次间隔1周,免疫结束后1周取兔血清,检测抗体的特异性。 结果:在相对分子质量为26 000的位置检测到了3C-6His融合蛋白的表达,成功构建了高效表达带His标签的3C重组蛋白载体。重组3C蛋白原核优化表达条件为37 ℃培养细菌6 h,加0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导。经SDS-PAGE分离菌体总蛋白,得到了纯化的3C重组蛋白。获得的兔免疫血清可以结合 E. Coli及HeLa细胞表达的3C蛋白,还能识别感染CVB3或肠道病毒A71的HeLa细胞中表达的3C蛋白。 结论:获得了抗CVB3 3C蛋白酶的多克隆抗体,这一抗体可特异结合肠道病毒的3C蛋白酶,为进一步研究3C蛋白酶在肠道病毒致病机制中的作用奠定了基础。
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编辑人员丨6天前
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中国YqAZF微缺失筛查室间质量评价结果分析(2017—2019)
编辑人员丨6天前
目的:分析2017年至2019年连续3年不同实验室Y染色体长臂无精子因子(Yq azoospermia factor,YqAZF)微缺失检测的室间质量评价(YqAZF microdeletion external quality assessment,YEQA)结果,以期为改进和规范YqAZF微缺失检测质量管理体系提供指导意见。方法:总结2017年至2019年期间由中国医师协会男科医师分会组织开展YEQA质控,每年向参与单位发放3个全血抽提的DNA质控品,包括无YqAZF微缺失、YqAZFb+c微缺失、YqAZFc微缺失等不同类型样本。各单位按规定要求上报检测方法、仪器和试剂、检测结果和结果解释等信息。专家对反馈结果进行评判及分析,得出分数和整体描述性评价。结果:2017年至2019年YEQA参与单位数逐年递增,3年累计报名172家,有效结果回收148家,回收率86.0%(148/172)。3年回收率分别为90.2%、92.6%、79.2%。参与单位来自9类不同实验室,以检验科/中心实验室、生殖/遗传中心为主;检测方法上,91.9%(136/148)为实时荧光PCR法检测;检测结果总分存在波动性,其中基因型检测平均得分率逐年递增(2017年至2019年分别为88.3%、93.0%、94.7%),而对检测结果的临床解释最为薄弱。2018年总平均分最高,为86.8分。结论:中国YEQA连续3年调查结果整体情况令人满意。但仍存在个别单位基因型检测错误、报告格式不规范、临床解释不全面等问题。检测单位应加强质量控制意识,及时采取措施纠正检测过程中出现的偏差和错误,积极参与YEQA计划,以提高YqAZF微缺失检测整体水平。
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编辑人员丨6天前
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不同层析介质纯化H5N1型流感病毒的研究
编辑人员丨6天前
目的:分别用新型复合层析介质Capto Core700和传统分子筛介质Sepharose 4FF纯化MDCK细胞制备的H5N1型流感病毒浓缩液,并比较分离纯化效果。方法:用Capto Core700与Sepharose 4FF纯化灭活H5N1型流感病毒浓缩液,透射电镜分析不同样品中病毒颗粒的形态;分别用单向免疫扩散法(single radial immunodiffusion, SRID)、福林酚法(Lowry法)、双抗体夹心ELISA、qPCR检测不同层析介质纯化前后病毒血凝素含量、总蛋白质含量、宿主细胞蛋白质(host cell protein, HCP)含量和宿主细胞DNA(host cell DNA, HCD)含量,计算病毒抗原回收率和杂质去除率;用动物实验检测不同纯化病毒的免疫原性,并用 t检验分析两种层析介质纯化效果差异。 结果:Capto Core700与Sepharose 4FF纯化的H5N1型流感病毒在透射电镜下均呈典型的流感病毒形态;两种层析介质纯化后病毒血凝素回收率差异无统计学意义( P>0.05),但前者的杂质(总蛋白质、HCP、HCD)去除率均高于后者,且差异有统计学意义( P<0.05);动物实验表明两种层析介质纯化的病毒样品均具有良好的免疫原性。 结论:相对于Sepharose 4FF层析介质,Capto Core700在保证病毒抗原蛋白回收率的基础上可以更有效地去除HCP、HCD和总蛋白质等工艺相关杂质。本研究为MDCK细胞生产H5N1型流感病毒疫苗纯化工艺开发提供了参考。
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编辑人员丨6天前
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建立基于适体-纳米金的比色生物传感器用于快速检测Lp-PLA2
编辑人员丨6天前
目的:筛选血管炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的DNA适体,并建立以非标记核酸适体-纳米金为探针的可视化检测方法。方法:方法学建立。通过磁珠固定SELEX技术经孵育结合、ssDNA分离、PCR扩增、单链回收的8轮循环筛选Lp-PLA2适体,利用表面等离子体共振技术和流式细胞术验证适体的亲和力和特异性,并通过计算机软件模拟适体二级结构及其与靶蛋白的三维分子对接。随后制备适体-纳米金复合物,利用靶标竞争结合导致纳米金溶液在盐诱导下凝聚引起颜色变化,分光光度计检测溶液的吸光度检测靶标浓度,建立样品溶液中Lp-PLA2浓度与吸光度的线性关系。结果:筛选获得3条高亲和力、强特异性的Lp-PLA2核酸适体B76-2、B76-4及B76-5,解离常数分别为1.07、1.26及1.75 nmol/L;并成功基于B76-2适体构建纳米金比色传感方法,其线性范围和检测限分别是20~500 ng/ml和78 ng/ml,反应时间30 min,可特异性区分靶标与其他血栓标志物如凝血酶和髓过氧化物酶。结论:利用核酸适体-纳米金显色实现了简单、快速、特异的Lp-PLA2可视化检测。
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编辑人员丨6天前
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体内噬菌体展示技术筛选人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽及其性质、结合效果研究
编辑人员丨6天前
目的:探讨体内噬菌体展示技术筛选的人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽的性质和结合效果,为乳腺癌早期诊断提供分子靶向探针。方法:制备人髓样乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型,采用噬菌体环七肽库进行3轮体内筛选。免疫组织化学法检测筛选的噬菌体在肿瘤及正常组织中的分布情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定单克隆噬菌体对Bcap-37细胞的亲合力。提取阳性单克隆噬菌体DNA并测序,选取重复率高的序列合成多肽,制备光学分子探针,应用荧光分子成像验证合成的多肽在荷瘤小鼠体内对乳腺移植瘤的特异性和靶向性。结果:第3轮体内筛选的噬菌体回收率为第1轮的107.2倍。免疫组织化学结果显示,随筛选轮次增加,肿瘤组织中结合的噬菌体依次增加;肿瘤组织结合的噬菌体多于正常组织(肺脏、骨骼肌、肝脏、肾脏),肿瘤组织切片扫描图像的吸光度( A)值均较正常组织高,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。ELISA结果显示,随机选取的50个单克隆噬菌体中,22个为阳性(亲合力≥2)。阳性单克隆噬菌体DNA测序分析后,得到4条有重复的氨基酸序列,选择重复率最高的氨基酸序列CSPLNTRFC,化学合成异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CSPLNTRFC多肽。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示,FITC-CSPLNTRFC多肽能明显富集在乳腺移植瘤组织。 结论:利用体内噬菌体展示技术能够筛选出可与人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的多肽CSPLNTRFC,有助于进行乳腺癌早期诊断的体外研究。
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编辑人员丨6天前
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围绕FFPE样本特性的DNA纯化纳米磁珠优化
编辑人员丨2周前
目的 探讨围绕福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded,FFPE)样本特性获取更高质量/得率的纳米磁珠核酸提取方案,改进分子病理技术.方法 合成4大类15个小类的备选磁珠,以FFPE样本为中心,筛选高质量/得率磁珠.模拟常规组织、粗针穿刺(肝脏)、纤维支气管镜样本(肺),装管相同张数连片.采用筛选的最佳磁珠与市场出售的常见磁珠试剂提取核酸,横向对比纯化总量、片段大小等质量参数.应用PCR和Sanger验证核酸的下游应用.结果 以FFPE样本DNA为中心筛选自制纳米磁珠,获得最佳性能纳米磁珠总回收率为58.5%±1.58%,5种市售商品化磁珠和3种国产磁珠总回收率为18.68%~40.71%.相同组织量(连片)提取的DNA总量,在模拟常规组织、粗针穿刺和纤维支气管镜样本核酸得率比市售试剂盒提高39.49%~181.72%(P<0.05).模拟纤维支气管镜样本1张(4 μm)总量可达100 ng以上、5张总量可达400 ng以上.结论 以FFPE样本DNA为中心筛选的DNA纯化纳米磁珠,与商品化磁珠相比有较大提升,为临床分子病理检测的质量保证、自动化检测和项目拓展提供空间.
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编辑人员丨2周前
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优化精液处理中的密度梯度离心法以提高受精结局的探讨
编辑人员丨3周前
[目的]本研究旨在改进生殖男科领域现有的精液处理方法,特别是针对双层密度梯度法中的300×g 20 min处理条件,以提高受精结局.[方法]收集2020年7月和9月以及2022年3月和5月在中山大学附属第六医院生殖医学中心进行辅助生殖助孕的1623例患者的精液标本进行实验.预实验中,比较四种不同的双层密度梯度方法(200×g 10 min、200×g 20 min、300×g 10 min和300×g 20 min)处理后标本的精子DNA碎片率和回收率.然后,筛选出一种最优的方法作为新方法,并与目前在用的旧方法(300×g 20 min双层梯度法)进行对比,检验受精率是否有统计学差异.在新方法的基础上,进一步优化为单层密度梯度法,并与双层密度梯度法进行对比,检验是否存在统计学差异.实验过程中严格控制温度、离心速度和离心时间,同时记录每组样本的数量和处理条件.[结果]在保证足够的精子回收率的基础上,发现四种双层密度梯度法中300×g 10 min的精子DNA碎片率低于300×g 20 min.因此,选择300×g 10 min作为新方法进行试验.结果 表明,新方法300×g 10 min的总受精率、二核体(2pn)受精率均高于300×g 20 min,且差异有统计学意义(P<0.05);300×g 10 min的卵裂率也略高于300×g 20 min,但差异没有统计学意义(P>0.05).单层密度梯度法的总受精率、2pn受精率均高于双层密度梯度法,但差异没有统计学意义(P>0.05);单层密度梯度法的卵裂率高于双层密度梯度法,囊胚形成率低于双层密度梯度法,且差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]相对于现有的300×g 20 min双层梯度法,300×g 10 min双层梯度法成功提高了总受精率、2pn受精率、卵裂率,缩短了精液优化处理的时间;而单层密度梯度法虽提高了卵裂率、节约了试剂成本和操作时间,但其囊胚形成率却出现了下降的情况.这些发现为生殖男科领域的精液处理方法提供了有益的指导和启示.
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编辑人员丨3周前
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高通量测序从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA侦破命案积案
编辑人员丨3周前
目的 从1999年案件中保留关键物证的凝胶电泳谱带中回收DNA,重新检测STR基因座重复单位序列和重复次数.方法 首先,确定凝胶电泳谱带中检测的STR基因座及引物序列,通过NCBI数据库查找获得STR基因座扩增序列范围,并在序列范围内重新设计扩增片段更小的引物,并验证引物扩增的特异性;其次,将凝胶中STR基因座谱带切割回收,每个基因座谱带单独回收;最后,用新设计的引物,扩增回收的模板DNA,再高通量测序.结果 从聚丙烯酰胺凝胶中成功回收到10个STR基因座DNA,并通过高通量测序获得10个STR基因座的重复单位序列和重复次数.结论 通过获得10个STR基因座的重复单位序列和重复次数排查侦破命案积案.
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编辑人员丨3周前
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金纳米颗粒表面催化发夹组装无酶信号放大快速荧光法检测微RNA-721
编辑人员丨2024/7/27
目的 构建一种自催化发夹组装无酶信号放大的靶标快速荧光法,用于检测靶标miRNA.方法 首先在金纳米颗粒(AuNP)表面修饰5-羧基荧光素(FAM)标记的DNA发夹探针H1,形成探针AuNP-H1,H1的荧光被AuNP猝灭.加入靶标miRNA会导致AuNP上的H1标记荧光素远离AuNP而重新发射荧光,随后H1与DNA发夹探针H2发生循环自组装,靶标循环被利用,导致荧光信号放大.将探针AuNP-H1、探针H2及不同浓度的miRNA-721共反应后,在480 nm激发波长下测定体系的荧光强度.结果 以急性心肌炎生物标志物miRNA-721为模型靶标,在优化的实验条件下使用20 μL探针AuNP-H1、50 μL 3 μmol/L探针H2(退火缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2,pH 7.4)与 50 μL不同浓度(0.1~5 μmol/L)的 miRNA-721 在 30 ℃共反应20 min,发现在520 nm处的相对荧光强度变化值(△F=F-F0)与miRNA-721浓度(C)呈良好的线性关系,拟合线性方程为△F=29 232×lgC-52 435(R2=0.991 0).该荧光法检测限为1.23 nmol/L.在正常人血清中的加标回收率为92.71%~104.02%.一次完整的miRNA分析可以在20 min内完成.结论 该方法可用于生物样品中miRNA-721的检测,为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段.
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编辑人员丨2024/7/27
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鲍曼不动杆菌OmpA蛋白的生物学特性分析
编辑人员丨2024/4/27
目的 提取临床分离的鲍曼不动杆菌外膜蛋白A(OmpA)的基因,并进行生物学预测和分析.方法 查询鲍曼不动杆菌OmpA基因序列,设计特异性PCR引物,以提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增OmpA片段.回收目的片段,采用生物信息学软件分析OmpA蛋白的生物学特性.结果 12株鲍曼不动杆菌多位点序列分型(MLST)序列分析有6个ST分型,分别是ST 208、ST 229、ST 191、ST 195、ST540、ST 1145,鲍曼不动杆菌OmpA基因序列全长为1 070 bp的,单核苷酸多态性(SNP)位点较少,预测蛋白为跨膜蛋白,具有6种三级结构,均由β-桶状结构组成的保守结构域.结论 临床分离的不同鲍曼不动杆菌株OmpA蛋白为结构相对保守的跨膜蛋白,具有维持细胞的形状和稳定性,参与细菌耐药机制及免疫原性作用.
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编辑人员丨2024/4/27
