目的:通过在单细胞水平分析小鼠磨牙细胞间异质性，构建牙髓细胞发育的时空图谱，进一步揭示牙齿发育的过程和调控机制。方法:分别收集出生后0、3 d的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙各10颗，制备单细胞悬液，采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术进行测序。从本课题组前期研究中提取出生后7 d小鼠磨牙scRNA-seq数据，与0、3 d数据进行合并分析。使用Seurat程序对测序数据进行质控、标准化、降维和聚类分析；Monocle程序进行拟时序分析，预测发育轨迹；Scillus程序进行基因本体分析，对细胞功能进行注释。使用原位杂交技术对标记基因进行体内定位，明确不同亚群细胞的体内分布和时空变化。结果:Seurat分析显示小鼠磨牙细胞具有26个细胞亚群，可分为牙髓细胞、牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、管周细胞、胶质细胞和红细胞等八大类细胞，其中牙髓细胞包含5个亚群：成熟牙髓细胞，标记基因为柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie virus and adenovirus receptor，Cxadr）；牙乳头细胞，标记基因为SPARC相关模块化钙结合蛋白2（SPARC related modular calcium binding 2，Smoc2）；周期细胞，标记基因为Ⅱ型DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase Ⅱ alpha，Top2a）；前成牙本质细胞，标记基因为棕榈酰蛋白羧酸酯酶（notum palmitoleoyl-protein carboxylesterase，Notum）；成牙本质细胞，标记基因为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，Dspp）。随着牙胚发育，成熟牙髓细胞的比例逐渐增加，周期细胞和成牙本质细胞比例逐渐降低。原位杂交染色和基因本体分析结果显示，Cxadr+成熟牙髓细胞定位于牙冠上部，主要功能为成骨和“细胞外结构组织”；Smoc2+牙乳头细胞位于根尖，主要功能与“细胞外结构组织”和器官发育相关；Top2a+周期细胞位于牙冠下部，进行有丝分裂；Notum+前成牙本质细胞邻近上皮根鞘，和Dspp+成牙本质细胞的主要功能同为生物矿化。Monocle分析显示牙髓细胞有2条发育轨迹，从Smoc2+牙乳头细胞起始，经过Top2a+周期细胞，再分化为Cxadr+成熟牙髓细胞或成牙本质细胞。结论:scRNA-seq技术能在转录组水平充分揭示细胞间的异质性，为研究器官发育过程和调控机制提供了有力工具。

目的:通过筛选能成功诱导人牙髓细胞（human dental pulp cell，HDPC）向成牙本质细胞样细胞分化的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的有效浓度，探讨体内诱导HDPC进行牙本质再生的ATP适宜浓度。方法:用0（对照组）、10、400、600、800 μmol/L ATP处理HDPC后，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）和蛋白质印迹法分别检测HDPC增殖以及成牙本质分化相关基因和蛋白[牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）]的表达；用茜素红染色评估诱导21 d后矿化结节情况（各组样本量均为5），并溶解矿化结节后定量分析各组溶液吸光度值（ A值）。筛选既能有效诱导HDPC成牙本质向分化，又能降低ATP对HDPC增殖抑制作用的浓度作为ATP的适宜浓度，并选用此浓度进行动物体内实验。HDPC经此浓度ATP预处理7 d后接种于明胶海绵上，并置入6~7 mm长、管径1.0~2.5 mm的人牙根管片段内（ATP处理组，样本量为8）；非ATP处理组的明胶海绵接种未经ATP预处理的HDPC（样本量为8），空白对照组的明胶海绵未接种细胞（样本量为2）。各组根管片段移植于免疫缺陷鼠（9只）背部双侧皮下，3个月后取材进行HE染色和组织学观察。 结果:培养5 d时与对照组相比，10 μmol/L ATP组HDPC增殖显著增加（ P<0.05），而600和800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著减小（ P<0.05），且800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著小于600 μmol/L ATP组（ P<0.05）。与对照组相比，600和800 μmol/L ATP组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均显著上调（ P<0.05），且两组间差异无统计学意义（ P>0.05），而其他各组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均无显著上调（ P>0.05）。诱导21 d后600和800 μmol/L ATP组均可见明显的矿化结节，其他组均未见矿化结节；定量分析显示0、10、400、600、800 μmol/L ATP组 A值分别为1.05±0.15、1.11±0.23、1.15±0.17、3.65±0.30、3.40±0.43，600与800 μmol/L ATP组 A值均显著大于其他各组（ P<0.05），且600与800 μmol/L ATP组间差异无统计学意义（ P>0.05）。HE染色结果显示，600 μmol/L ATP可诱导HDPC在根管牙段内分化形成牙本质样结构。 结论:600 μmol/L为ATP诱导HDPC成牙本质向分化的适宜浓度，该浓度ATP可在免疫缺陷小鼠体内诱导HDPC形成牙本质样结构。

目的:探究转录因子激活蛋白2家族的成员转录因子激活蛋白2C（TFAP2C）在小鼠磨牙牙胚发育过程中的表达及其影响。方法:实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）分析胚胎（E）14.5小鼠胚胎各器官及E12.5~E18.5和出生后0~7天的小鼠磨牙牙胚内Tfap2c的相对表达水平，冰冻切片免疫荧光染色显示Tfap2c在小鼠磨牙牙胚内的表达位置。采用牙胚体外培养的方法，探究敲降Tfap2c对小鼠磨牙牙胚发育的影响，RT-qPCR检测成牙本质细胞表达相关基因的相对表达水平。分离并提取小鼠牙胚间充质细胞进行培养，探究敲降Tfap2c对小鼠牙胚间充质细胞的影响，划痕愈合实验检测细胞迁移，细胞计数（CCK-8）法检测细胞增殖。结果:Tfap2c基因在小鼠磨牙牙胚发育早期相对表达水平较高。E13.5，Tfap2c在小鼠磨牙牙胚上皮组织与间充质组织内均有表达，二者的相对表达水平差异无统计学意义（ t=1.06， P=0.472）。E14.5，Tfap2c在小鼠磨牙牙胚初级釉结附近的间充质组织内表达，小鼠磨牙牙胚间充质组织内Tfap2c的相对表达水平（1.000±0.036）显著高于上皮组织（0.199±0.008）（ t=37.29， P<0.001）。体外培养小鼠磨牙牙胚并敲降Tfap2c后，小鼠磨牙牙胚牙尖相对高度（0.708±0.171）及牙尖高度与牙冠高度的比值（0.321±0.068）均显著低于对照组（分别为1.000±0.287和0.483±0.166）（ t=2.79， P=0.012； t=2.85， P=0.015）；对照组的牙冠相对高度（1.078±0.206）及相对宽度（1.000±0.116）与敲降组的差异均无统计学意义（分别为0.993±0.254和0.999±0.122）（ t=0.83， P=0.419； t=0.01， P=0.992）。体外培养小鼠磨牙牙胚内敲降Tfap2c，成牙本质细胞表达相关基因Dspp和Dmp1相对表达水平均显著低于对照组（ t=15.33， P<0.001； t=13.81， P<0.001）。在小鼠牙胚间充质细胞内敲降Tfap2c，划痕愈合实验显示，对照组细胞48 h划痕宽度显著小于敲降组（ t=29.86， P=0.001）；CCK-8法检测显示对照组与敲降组细胞间各时间点吸光度值的差异均无统计学意义（ P>0.05）；Tfap2c敲降组牙胚间充质细胞内成牙本质细胞表达相关基因Dspp和Dmp1相对表达水平均显著低于对照组（ t=3.86， P=0.031； t=4.36， P=0.022）。 结论:Tfap2c在小鼠磨牙牙胚发育早期表达，主要表达于小鼠磨牙牙胚间充质组织内，敲降Tfap2c影响小鼠磨牙牙胚牙尖形成，影响牙胚间充质细胞迁移。

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法.目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响.方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力.将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达.结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05).结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力.

目的:探讨连接蛋白43(connexin 43,Cx43)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)成牙本质分化过程中的作用和机制.方法:建立SD大鼠上颌第一磨牙损伤模型,免疫荧光(im munofluorescence,IF)染色检测Cx43在牙髓组织损伤后修复中的表达模式变化.分别采用0、1、10、100和1 000 ng/mL LPS刺激hDPCs 6 h,筛选最适浓度,随后抑制和过表达hDPCs中Cx43的表达.实时定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹法检测Cx43和成牙本质分化相关因子牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dental matrix protein-1,DMP-1)、成骨相关转录因子(osterix,Osx)表达及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性变化.进一步对hDPCs施以特异性Cx43通道抑制剂,检测Cx43介导的通道活性在hDPCs成牙本质分化中的作用,初步探讨Cx43调节LPS诱导的hDPCs成牙本质分化的作用和机制.采用SPSS 26.0软件包对数据进行统计学处理.结果:IF结果显示,在健康牙髓组织中,Cx43主要表达于成牙本质细胞层,牙损伤3～24h,Cx43表达减弱,随后逐渐上调,直至正常水平;损伤后3天～2周,表达呈下调趋势,并且表达于成牙本质细胞层和固有牙髓中.以10 ng/mL LPS刺激hDPCs 6 h,可显著上调DSPP的mRNA表达(P＜0.01).抑制Cx43,可显著上调hDPCs内LPS诱导的DSPP、DMP-1和Osx mRNA表达(P＜0.05);过表达Cx43,则显著抑制LPS诱导的成牙本质分化相关因子表达(P＜0.01)和DSPP荧光强度.以10 ng/mL LPS激活hDPCs内ERK信号,过表达Cx43可显著减弱LPS诱导的ERK信号活性(P＜0.01).抑制Cx43介导的半通道,促进LPS诱导的hDPCs成牙本质分化相关因子mRNA表达和ERK信号活性(P＜0.05);而阻断Cx43介导的细胞间通道,则抑制成牙本质分化.结论:Cx43参与调控牙髓组织的损伤后修复,并且其表达整体呈下调趋势;抑制Cx43或阻断HC,可促进LPS诱导的ERK信号活性和hDPCs成牙本质分化.

Tooth root development involves intricate spatiotemporal cellular dynamics and molecular regulation.The initiation of Hertwig's epithelial root sheath(HERS)induces odontoblast differentiation and the subsequent radicular dentin deposition.Precisely controlled signaling pathways modulate the behaviors of HERS and the fates of dental mesenchymal stem cells(DMSCs).Disruptions in these pathways lead to defects in root development,such as shortened roots and furcation abnormalities.Advances in dental stem cells,biomaterials,and bioprinting show immense promise for bioengineered tooth root regeneration.However,replicating the developmental intricacies of odontogenesis has not been resolved in clinical treatment and remains a major challenge in this field.Ongoing research focusing on the mechanisms of root development,advanced biomaterials,and manufacturing techniques will enable next-generation biological root regeneration that restores the physiological structure and function of the tooth root.This review summarizes recent discoveries in the underlying mechanisms governing root ontogeny and discusses some recent key findings in developing of new biologically based dental therapies.

The biomolecular mechanisms that regulate tooth root development and odontoblast differentiation are poorly understood.We found that Atp6i deficient mice(Atp6i-/-)arrested tooth root formation,indicated by truncated Hertwig's epithelial root sheath(HERS)progression.Furthermore,Atp6i deficiency significantly reduced the proliferation and differentiation of radicular odontogenic cells responsible for root formation.Atp6i-/-mice had largely decreased expression of odontoblast differentiation marker gene expression profiles(Col1a1,Nfic,Dspp,and Osx)in the alveolar bone.Atp6i-/-mice sample RNA-seq analysis results showed decreased expression levels of odontoblast markers.Additionally,there was a significant reduction in Smad2/3 activation,inhibiting transforming growth factor-β(TGF-β)signaling in Atp6i-/-odontoblasts.Through treating pulp precursor cells with Atp6i-/-or wild-type OC bone resorption-conditioned medium,we found the latter medium to promote odontoblast differentiation,as shown by increased odontoblast differentiation marker genes expression(Nfic,Dspp,Osx,and Runx2).This increased expression was significantly blocked by anti-TGF-β1 antibody neutralization,whereas odontoblast differentiation and Smad2/3 activation were significantly attenuated by Atp6i-/-OC conditioned medium.Importantly,ectopic TGF-β1 partially rescued root development and root dentin deposition of Atp6i-/-mice tooth germs were transplanted under mouse kidney capsules.Collectively,our novel data shows that the prevention of TGF-β1 release from the alveolar bone matrix due to OC dysfunction may lead to osteopetrosis-associated root formation via impaired radicular odontoblast differentiation.As such,this study uncovers TGF-β1/Smad2/3 as a key signaling pathway regulating odontoblast differentiation and tooth root formation and may contribute to future therapeutic approaches to tooth root regeneration.

目的:探讨miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化的影响及信号通路调控机制.方法:对hDPSCs转染miR-20a-3p-mimic和miR-20a-3p-inhibitor来上调或下调其表达,然后对hDPSCs进行成牙本质分化诱导培养.通过茜素红染色观察细胞钙基质的矿化程度并检测ALP活性.通过双荧光素酶报告基因测定实验验证miR-20a-3p与mothers against decapentaplegic homolog(SMAD)特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMURF1)的靶向调节关系.通过RT-qPCR检测hDPSCs中miR-20a-3p以及SMURF1、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平.结果:与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的茜素红相对染色强度升高了67.09％,miR-20a-3p-inhibitor组降低了46.13％(P＜0.05).与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的相对ALP活性升高了52.89％,miR-20a-3p-inhibitor组降低了53.32％(P＜0.05).与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的RUNX2、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别升高了 2.19倍、1.86倍和2.35倍,miR-20a-3p-inhibitor组分别降低了63.26％、58.84％和68.12％(P＜0.05).双荧光素酶报告基因测定显示miR-20a-3p靶向抑制SMURF1(P＜0.05).过表达SMURF1抑制了 miR-20a-3p对成牙本质分化的影响(P＜0.05).结论:miR-20a-3p通过靶向抑制SMURF1及其下游基因促进hDPSCs的成牙本质分化.

Mouse dental papilla cells(mDPCs)are cranial neural crest-derived dental mesenchymal cells that give rise to dentin-secreting odontoblasts after the bell stage during odontogenesis.The odontoblastic differentia-tion of mDPCs is spatiotemporally regulated by transcription factors(TFs).Our previous work reveals that chromatin accessibility was correlated with the occupation of the basic leucine zipper TF family during odontoblastic differentiation.However,the detailed mechanism by which TFs regulate the initiation of odontoblastic differentiation remains elusive.Here,we report that phosphorylation of ATF2(p-ATF2)is particularly increased during odontoblastic differentiation in vivo and in vitro.ATAC-seq and p-ATF2 CUT&Tag experiments further demonstrate a high correlation between p-ATF2 localization and increased chromatin accessibility of regions near mineralization-related genes.Knockdown of Atf2 inhibits the odontoblastic differentiation of mDPCs,while overexpression of p-ATF2 promotes odontoblastic differen-tiation.ATAC-seq after overexpression of p-ATF2 reveals that p-ATF2 increases the chromatin accessibility of regions adjacent to genes associated with matrix mineralization.Furthermore,we find that p-ATF2 physically interacts with and promotes H2BK12 acetylation.Taken together,our findings reveal a mech-anism that p-ATF2 promotes odontoblastic differentiation at initiation via remodeling chromatin accessibility and emphasize the role of the phosphoswitch model of TFs in cell fate transitions.

目的:研究转录因子Krüpple样因子5(Krüpple-like factor 5,KLF5)在人牙髓-牙本质复合体中的表达,探讨其在成牙本质细胞分化及牙本质形成过程中的作用.方法:应用免疫组织化学方法检测KLF5在人牙髓-牙本质复合体中及牙髓细胞矿化诱导过程中的表达,Western印迹法检测KLF5在成牙本质细胞分化过程中的表达变化.采用SPSS17.0软件包对实验结果进行单因素方差分析和Tukey检验.结果:在正常及龋坏牙中,KLF5表达于人成牙本质细胞和成牙本质样细胞,而在牙本质及前期牙本质中无表达.细胞免疫组织化学结果显示,在矿化诱导0、7、14d的人牙髓细胞中,KLF5在细胞核中呈强阳性表达.Western印迹结果显示,随着矿化诱导时间的延长,KLF5蛋白表达量逐渐增加.诱导14～21 d时,KLF5表达量增加最显著.结论:KLF5可能参与成牙本质细胞分化及牙本质的形成过程.