目的:研究外泌体负载的枸杞miRNA(Lb-miR2911)药物通过跨界调控Wnt/β-catenin信号通路对非梗阻性无精子症(NOA)大鼠模型生精功能恢复的影响.方法:4 周龄雄性SD大鼠30 只,采用白消安腹腔注射方法构建NOA模型,造模5 周后将模型大鼠随机分为模型组(MC)、Lb-miR2911EXO治疗组(Lb-miR2911EXO)、外泌体空载治疗组(Sham),每组10 只.MC组NOA模型大鼠自然恢复,无特殊处理;Lb-miR2911EXO组NOA模型大鼠,睾丸生精小管注射外泌体包被Lb-miR2911 药物(0.1 mg/kg),1 次/周,共治疗 3 次;Sham组NOA模型大鼠,睾丸生精小管注射外泌体空载药物(0.1 mg/kg),1 次/周,共治疗3 次.另取10 只同龄正常健康SD大鼠作为正常对照组(NC).治疗后第2、6 周采用RNA FISH技术观察Lb-miR2911 药物在睾丸组织中的摄取及代谢变化;治疗后 12周采用转录组测序分析结合 Western 印迹、RT-PCR 方法检测各组大鼠睾丸组织中细胞增殖、精子发生及Wnt/β-catenin信号通路的基因表达;睾丸组织形态学及精子质量分析比较各组大鼠生精功能恢复情况;通过组织形态学分析结合血清TNF-α、IL-1β、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等指标检测评估Lb-miR2911 外泌体药物对大鼠组织器官毒性.结果:治疗12 周后睾丸组织形态学分析发现Lb-miR2911EXO组大鼠睾丸组织各层次生精细胞排列规则,管腔中可见大量成熟精子,与Sham组比较,Johnsen评分显著增加(P<0.05),睾丸重量、睾丸指数、精子浓度和精子活力显著增加(P<0.05);转录组测序分析结合Western 印迹、RT-PCR方法证实,与MC组相比,Lb-miR2911EXO组DACT3 基因表达下调(P<0.05),而DVL2、β-catenin表达上调,同时p-DVL2及β-catenin(nucleus)蛋白含量增加(P<0.05);细胞增殖相关基因CCND1、CCNE1、CCNE2 mRNA表达上调(P<0.05);精子发生相关基因 DMC1、CCR6、JAM2、KLC3 表达上调(P<0.05);组织器官毒性检测表明:治疗后Lb-miR2911EXO组大鼠肺部、肝脏、肾脏组织未见病理性变化,与NC组比较血清TNF-α、IL-1β、AST、ALT、肌酐或尿素氮等水平未见升高(P>0.05).结论:外泌体负载的Lb-miR2911 药物通过跨界调节DACT3/Wnt/β-Catenin信号通路促进了NOA大鼠生精功能恢复.

目的:通过转录组测序技术探讨仙连解毒方治疗Ⅲ期结直肠癌患者的潜在疗效机制。方法:本研究针对Ⅲ期结直肠癌患者，随机选取仙连解毒方给药组和未接受仙连解毒方给药(对照组)的肿瘤组织样本各4例，进行全转录组测序，鉴定差异表达基因、富集功能通路及构建miRNA-mRNA调控网络。结果:通过两组样本比较，服用仙连解毒方的结直肠癌患者样本中存在多个差异表达的miRNA、mRNA，包括hsa-miR-105-5p、hsa-miR-129-1-3p和hsa-miR-135a-5p等，及ANKRD31、ESPNL和DACT2等。功能富集分析显示仙连解毒方治疗后，膜转运功能、类固醇激素应答、IL-4及IL-13等肿瘤相关通路显著富集。结论:仙连解毒方可能通过调控miRNA、mRNA的表达水平，影响相关通路，从而干预Ⅲ期结直肠癌患者的肿瘤进展。

目的:利用生物信息学技术探索人卵巢癌细胞株A2780对顺铂耐药基因的可能机制,为临床化疗提供有效的依据.方法:①通过GEO在线GE02R工具从两组数据库(GSE15372和GSE33482)中,分别比较对顺铂耐药的A2780与对顺铂敏感的A2780中的基因表达差异,并筛选出高表达基因和低表达基因;使用维恩图确定两组数据库中耐药的高表达共同差异基因和低表达的共同差异基因.②利用GO分析和KEGG通路富集分析耐药基因的生物学功能.③利用蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络及Cytoscape软件筛选出A2780对顺铂耐药核心靶基因.④利用Kaplan-Meier Plotter工具对Hub基因进行总生存期分析.结果:①两组数据集的高表达共同耐药基因共37个,低表达共同耐药基因共2个.②GO分析结果显示:生物学过程(BP)分析结果表明,耐药基因主要参与着细胞间信号传导、趋化作用等;细胞组成(CC)分析表明,耐药基因主要位于细胞外区域、细胞间隙、细胞表面;分子功能(MF)分析表明,耐药基因参与着趋化因子相结合等作用.KEGG通路富集分析显示,耐药基因主要在细胞因子与细胞因子受体相互作用的信号通路、趋化因子信号通路上发挥作用.③PPI网络及 Hub 基因筛选结果显示:CCR5、POSTN、LOX、DACT1、RTN1、CCR1、CXCL6、PITX2、SNCA、AREG是核心耐药基因.④Hub基因中POSTN、LOX、DACT1、RTN1、PITX2的高表达与卵巢癌的不良预后有关(P＜0.05).结论:人卵巢癌细胞株A2780中顺铂耐药基因的异常表达,在卵巢癌化疗耐药中发挥着重要的作用,需要进一步的体外实验研究来证实其在临床化疗耐药中的作用.

目的 探究基因DACT3促进神经胶质瘤细胞(U251、U118)铁死亡的分子机制.方法培养人U251、U118胶质瘤细胞,慢病毒转染构建稳定过表达DACT3的细胞后,qRT-PCR和Western blot检测转染效率.上述细胞分成3组:Ctrl组(对照组)、DACT3组(过表达DACT3细胞组)和DACT3+ferrostatin-1组(过表达DACT3+铁死亡抑制剂).采用CCK-8检测细胞生存率,铁离子、MDA、谷胱甘肽(glutatione,GSH)检测试剂盒测定细胞铁离子、MDA、GSH 含量,Western blot 检测 GPX4、SLC7A11、TFR1表达.进一步将上述细胞分为以下3组:Ctrl组(对照组)、DACT3组(过表达DACT3细胞组)和DACT3+siBMP4组(过表达DACT3+敲低BMP4组),再次利用CCK-8检测细胞生存率,铁离子、MDA、GSH检测试剂盒测定细胞铁离子、MDA、GSH 含量,Western blot 检测 GPX4、SLC7A11、TFR1、BMP4、p-Smad 表达.结果 DACT3组中DACT3 mRNA和蛋白表达均显著高于Ctrl组;与Ctrl组比较,DACT3组细胞生存率明显下降,铁离子、MDA含量显著升高,GSH含量明显下降,GPX4、SLC7A11表达显著下降,TFR1、p-Smad、BMP4表达明显升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05);DACT3+ferrostatin-1组、DACT3+siBMP4组均能一定程度抵消DACT3导致的上述指标的变化,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论DACT3可以促进U251、U118胶质瘤细胞铁死亡,其机制与BMP4/SMAD信号通路激活有关.

目的 探讨DACT2在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中的表达改变及其调控机制.方法 免疫组织化学(immunohis-tochemisty,IHC)方法检测16例CRC临床标本中DACT2的表达.PCR检测甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理前后CRC细胞系中DACT2 mRNA的表达,甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)、亚硫酸氢盐修饰后测序(Bisulfite sequencing,BSSQ)检测组织标本和细胞系中DACT2的甲基化状态.对比分析基因表达与甲基化的对应关系.结果 DACT2在正常结肠黏膜和癌旁组织中呈强阳性表达.与对应的癌旁组织相比,部分CRC组织中DACT2表达下调,比例为68.75%. DACT2在RKO细胞系中表达缺失,在HT-29中呈弱表达,甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理后表达恢复或增强.MSP、BSSQ分析显示,RKO呈完全甲基化,而HT-29、DLD-1、SW480呈部分甲基化.CRC组织标本中DACT2甲基化率为56.25%.基因启动子高甲基化与DACT2表达呈对应关系(P=0.009).结论 DACT2表达降低可能参与了CRC的发生、发展,而DNA 高甲基化是DACT2的表达调控机制之一.

目的:探讨真武汤联合新辅助化疗对卵巢癌病灶内癌细胞恶性特征的影响.方法:选择在本院接受手术治疗的卵巢癌患者80例,回顾治疗方案并分为接受术前新辅助化疗的对照组42例、接受术前真武汤联合新辅助化疗的真武汤组38例.留取术中卵巢癌组织并采用荧光定量PCR法检测其中增殖基因、侵袭基因、自噬基因的表达量.结果:真武汤组患者卵巢病灶组织中增殖基因 AKT 、LSD1 、SIRT1 、NOB1 mRNA的表达量低于对照组;侵袭基因DACT1 mRNA 的表达量高于对照组,MTA1 、GRP78 mRNA的表达量低于对照组;自噬基因Beclin1 mRNA 的表达量高于对照组,LC3-Ⅱ、Atg5 m RN A的表达量低于对照组.结论:卵巢癌患者术前接受真武汤联合新辅助化疗,可有效抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭活性并调节其自噬功能.

目的:研究dapper,β-连环蛋白拮抗剂,非洲爪蟾同系物1(dapper,antagonist of beta-catenin,homolog 1 Xenopus laevis,DA CT1)在儿童急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)中的羟甲基化特征及其与预后的关系,寻找AML新的危险分层分子标志物.方法:测序分析本院血液科初发AML188例,根据是否存在Wilms肿瘤因子1(Wilms tumor 1,WT1)、异柠檬酸脱氢酶1/2(isocitrate dehydrogenase 1/2,IDH1/2)或TET蛋白2(ten-eleven translocation,TET2)基因突变,将病例分为WIT-AML组(30例)和非WIT-AML组(158例);用糖基化qPCR及qPCR方法检测WIT-AML(16例)、非WIT-AML(14例)和非AML患儿(14例)的DA CT1基因羟甲基化水平(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)和表达水平,并用Spearman法研究羟甲基化与表达的相关性;随访患儿的缓解、复发及生存情况,采用COX回归分析DA CT1羟甲基化对AML患儿总生存率(overall survival,OS)及无病生存率(event free survival,EFS)的影响.结果:WIT-AML组的DA CT1a、b区域(DA CT1 a/b)甲基岛(CpG)羟甲基化(5hmC)水平较非WIT-AML组低(Ua=48.00,Pa=0.008;Ub=19.00,Pb=0.000),且其基因表达明显减低(U~p=0.00,P~p=0.000);DA CT1 a/b甲基岛5hmC与DA CT1的表达水平呈正相关(ra=0.812,Ra=0.000;rb=0.789,Pb=0.000);DA CT1a 5hmC水平减低是EFS的危险因素(HR=3.896,95％C1=1.161～13.073,P=0.028),同样也是OS的危险因素(HR=4.109,95％CI=1.226～13.771,P=0.022).结论:在WIT-AML中,DA CT1 5hmC水平和表达水平明显降低,DA CT1a区5hmC水平降低可增加儿童AML生存风险,可作为AML一个新的独立预后不良指标.

目的 筛选与先天性心脏病(CHD)相关的DACT1基因的错义突变,并研究其生物学功能.方法 研究对象为中国山东地区汉族人群,病例组为2008年8月至2011年1月散发CHD的连续就诊患儿,排除综合征型和有心脏病家族史患者;对照组为同时期收集的排除CHD以及有心脏病家族史的健康儿童.①提取两组外周静脉血WBC的基因组DNA,靶向DACT1基因的编码区进行测序,将测序结果中的单核苷酸变异(SNV)与数据库dbSNP(version137)和千人基因组比对,病例组与对照组的SNV比对,筛选出病例特异性的新发现或稀有DACT1突变位点,通过Sanger法验证.②构建野生型和各突变型DACT1的表达质粒,在HEK293T细胞中通过蛋白质免疫印迹实验观察DACT1和DVL2蛋白表达水平.③通过双荧光素酶报告基因实验观察突变后DACT1对经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路(PCP)调控作用的变化.结果 病例组404例,年龄(2.9±2.7)岁;对照组213名,年龄(7.1±3.7)岁.病例组和对照组的男女比例分别为1.2:1和1:1,均为汉族儿童.在3例CHD中筛选到4个DACT1基因编码区的新发现或稀有的错义突变c.1486C>T(p.S441L)、c.1598C>A(p.S478R)、c.1659G>C(p.E499Q)和c.1891T>A(p.M576K),经Sanger测序验证均为杂合突变.DACT1S478R和DACT1E499Q在不同物种中保守性很高.DACT1S441L SIFT评价为有害突变;DACT1E499Q PolyPhen-2评价为可能有害(0.978),DACT1S478R和DACT1M576K SIFT和PolyPhen-2预测为无有害性.4种突变型对DACT1蛋白的表达水平均无明显影响.与野生型DACT1相比较,突变型DACT1E499Q对DVL2蛋白的下调作用减弱(P<0.05),对经典Wnt信号通路以及PCP信号通路的抑制作用也减弱(P<0.01).结论 DACT1E499Q错义突变可能通过减弱对Wnt信号通路活性的抑制来促进CHD的发生.

目的 研究过表达DACT1通过调节凋亡相关蛋白对人白血病细胞增殖的抑制作用.方法 在人白血病K562细胞中,通过基因转染试剂对空载质粒vector与DACT1质粒分别进行转染,分别作为阴性对照组与观察组,并使DACT1呈现过表达.另设置一组未经任何处理的细胞为空白对照组.通过流式细胞术、CCK-8法对DACT1过表达后K562细胞周期、增殖、凋亡的影响进行检测.并采用Western blot法对DACT1过表达后调节凋亡相关蛋白的表达进行检测.结果 观察组克隆形成率为(6.33±0.98)％,较空白对照组(20.74±3.12)％、阴性对照组(20.43±3.32)％均明显降低(P<0.05).细胞增殖实验结果发现,观察组细胞增殖活性较空白对照组、阴性对照组均显著降低.观察组细胞凋亡率为(28.97±3.04)％,较空白对照组(0.85±0.12)％、阴性对照组(0.83±0.09)％均显著升高(P<0.05).观察组细胞G0/G1期比例较空白对照组、阴性对照组显著增加(P<0.05).观察组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等促凋亡蛋白表达较空白对照组和阴性对照组均显著上调,而B淋巴细胞癌-2(Bcl-2)等抗凋亡蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组均显著降低.结论 在人白血病K562细胞中,DACT1过表达可阻滞细胞增殖,促使细胞凋亡,亦会影响细胞周期,使得细胞出现G0/G1期阻滞.分析其原因,可能与DACT1过表达具有潜在的抗肿瘤作用,其作用机制可能与上调促凋亡蛋白(caspase-3、caspase-9、Bcl-2)表达和抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达密切相关.

目的:初步探索分泌型cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(typeⅡcGMP-dependent protein kinase,PKGⅡ)对人胃癌HGC-27和AGS细胞株基因表达的影响.方法:采用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对使用谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)标签表达的重组全长人PKGⅡ处理前、后的人胃癌AGS细胞株转录组进行测序;从表达差异明显的基因中筛选与肿瘤细胞增殖相关的基因,采用qRT-PCR法验证在cGMP类似物8-pCPT-cGMP的激活下重组PKGⅡ对相关基因转录水平的影响,并通过蛋白质免疫印迹进一步验证其对相关蛋白表达水平的影响.结果:转录组测序结果显示,579个基因表达有明显差异,其中267个基因表达显著上调,312个显著下调;筛选9个与肿瘤细胞增殖相关的基因进行qRT-PCR检测,证实在GST-PKGⅡ和8-pCPT-cGMP共同作用下,EGF、DFNA5、DACT1、PSCA等mRNA水平在AGS和HGC-27两个细胞株中都表现出与转录组测序一致的趋势(与空白对照组相比P均<0.05);蛋白质免疫印迹结果显示,在GST-PKGⅡ和8-pCPT-cGMP共同作用下,表皮生长因子蛋白水平下调,与转录组测序和qRT-PCR结果一致.结论:分泌型PKGⅡ可从转录水平调控人胃癌HGC-27和AGS细胞中EGF等增殖相关基因的表达,并能够抑制EGF的翻译.