目的:研究外泌体负载的枸杞miRNA(Lb-miR2911)药物通过跨界调控Wnt/β-catenin信号通路对非梗阻性无精子症(NOA)大鼠模型生精功能恢复的影响.方法:4 周龄雄性SD大鼠30 只,采用白消安腹腔注射方法构建NOA模型,造模5 周后将模型大鼠随机分为模型组(MC)、Lb-miR2911EXO治疗组(Lb-miR2911EXO)、外泌体空载治疗组(Sham),每组10 只.MC组NOA模型大鼠自然恢复,无特殊处理;Lb-miR2911EXO组NOA模型大鼠,睾丸生精小管注射外泌体包被Lb-miR2911 药物(0.1 mg/kg),1 次/周,共治疗 3 次;Sham组NOA模型大鼠,睾丸生精小管注射外泌体空载药物(0.1 mg/kg),1 次/周,共治疗3 次.另取10 只同龄正常健康SD大鼠作为正常对照组(NC).治疗后第2、6 周采用RNA FISH技术观察Lb-miR2911 药物在睾丸组织中的摄取及代谢变化;治疗后 12周采用转录组测序分析结合 Western 印迹、RT-PCR 方法检测各组大鼠睾丸组织中细胞增殖、精子发生及Wnt/β-catenin信号通路的基因表达;睾丸组织形态学及精子质量分析比较各组大鼠生精功能恢复情况;通过组织形态学分析结合血清TNF-α、IL-1β、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等指标检测评估Lb-miR2911 外泌体药物对大鼠组织器官毒性.结果:治疗12 周后睾丸组织形态学分析发现Lb-miR2911EXO组大鼠睾丸组织各层次生精细胞排列规则,管腔中可见大量成熟精子,与Sham组比较,Johnsen评分显著增加(P<0.05),睾丸重量、睾丸指数、精子浓度和精子活力显著增加(P<0.05);转录组测序分析结合Western 印迹、RT-PCR方法证实,与MC组相比,Lb-miR2911EXO组DACT3 基因表达下调(P<0.05),而DVL2、β-catenin表达上调,同时p-DVL2及β-catenin(nucleus)蛋白含量增加(P<0.05);细胞增殖相关基因CCND1、CCNE1、CCNE2 mRNA表达上调(P<0.05);精子发生相关基因 DMC1、CCR6、JAM2、KLC3 表达上调(P<0.05);组织器官毒性检测表明:治疗后Lb-miR2911EXO组大鼠肺部、肝脏、肾脏组织未见病理性变化,与NC组比较血清TNF-α、IL-1β、AST、ALT、肌酐或尿素氮等水平未见升高(P>0.05).结论:外泌体负载的Lb-miR2911 药物通过跨界调节DACT3/Wnt/β-Catenin信号通路促进了NOA大鼠生精功能恢复.

目的:通过转录组测序技术探讨仙连解毒方治疗Ⅲ期结直肠癌患者的潜在疗效机制。方法:本研究针对Ⅲ期结直肠癌患者，随机选取仙连解毒方给药组和未接受仙连解毒方给药(对照组)的肿瘤组织样本各4例，进行全转录组测序，鉴定差异表达基因、富集功能通路及构建miRNA-mRNA调控网络。结果:通过两组样本比较，服用仙连解毒方的结直肠癌患者样本中存在多个差异表达的miRNA、mRNA，包括hsa-miR-105-5p、hsa-miR-129-1-3p和hsa-miR-135a-5p等，及ANKRD31、ESPNL和DACT2等。功能富集分析显示仙连解毒方治疗后，膜转运功能、类固醇激素应答、IL-4及IL-13等肿瘤相关通路显著富集。结论:仙连解毒方可能通过调控miRNA、mRNA的表达水平，影响相关通路，从而干预Ⅲ期结直肠癌患者的肿瘤进展。

目的 探究基因DACT3促进神经胶质瘤细胞(U251、U118)铁死亡的分子机制.方法培养人U251、U118胶质瘤细胞,慢病毒转染构建稳定过表达DACT3的细胞后,qRT-PCR和Western blot检测转染效率.上述细胞分成3组:Ctrl组(对照组)、DACT3组(过表达DACT3细胞组)和DACT3+ferrostatin-1组(过表达DACT3+铁死亡抑制剂).采用CCK-8检测细胞生存率,铁离子、MDA、谷胱甘肽(glutatione,GSH)检测试剂盒测定细胞铁离子、MDA、GSH 含量,Western blot 检测 GPX4、SLC7A11、TFR1表达.进一步将上述细胞分为以下3组:Ctrl组(对照组)、DACT3组(过表达DACT3细胞组)和DACT3+siBMP4组(过表达DACT3+敲低BMP4组),再次利用CCK-8检测细胞生存率,铁离子、MDA、GSH检测试剂盒测定细胞铁离子、MDA、GSH 含量,Western blot 检测 GPX4、SLC7A11、TFR1、BMP4、p-Smad 表达.结果 DACT3组中DACT3 mRNA和蛋白表达均显著高于Ctrl组;与Ctrl组比较,DACT3组细胞生存率明显下降,铁离子、MDA含量显著升高,GSH含量明显下降,GPX4、SLC7A11表达显著下降,TFR1、p-Smad、BMP4表达明显升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05);DACT3+ferrostatin-1组、DACT3+siBMP4组均能一定程度抵消DACT3导致的上述指标的变化,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论DACT3可以促进U251、U118胶质瘤细胞铁死亡,其机制与BMP4/SMAD信号通路激活有关.

目的:研究过表达DACT1对白血病K562细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,并探讨其作用机制.方法:用Attractene Transfection试剂在K562细胞中转染DACT1质粒,使其在细胞中过表达,应用CCK-8法、流式细胞术检测过表达DACT1对K562细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响.Western blot法检测过表达DACT1后凋亡相关蛋白的变化.结果:过表达DACT1能够抑制K562细胞集落形成,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞发生G 0/G1期阻滞.同时可使促凋亡蛋白Bax、caspase-3及caspase-9表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少.结论:过表达DACT1可以抑制白血病K562细胞增殖并诱导其凋亡,干扰其增殖周期,可能具有潜在的抑癌作用,其机制可能与调节凋亡相关蛋白有关.

目的:探讨真武汤联合新辅助化疗对卵巢癌病灶内癌细胞恶性特征的影响.方法:选择在本院接受手术治疗的卵巢癌患者80例,回顾治疗方案并分为接受术前新辅助化疗的对照组42例、接受术前真武汤联合新辅助化疗的真武汤组38例.留取术中卵巢癌组织并采用荧光定量PCR法检测其中增殖基因、侵袭基因、自噬基因的表达量.结果:真武汤组患者卵巢病灶组织中增殖基因 AKT 、LSD1 、SIRT1 、NOB1 mRNA的表达量低于对照组;侵袭基因DACT1 mRNA 的表达量高于对照组,MTA1 、GRP78 mRNA的表达量低于对照组;自噬基因Beclin1 mRNA 的表达量高于对照组,LC3-Ⅱ、Atg5 m RN A的表达量低于对照组.结论:卵巢癌患者术前接受真武汤联合新辅助化疗,可有效抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭活性并调节其自噬功能.

目的 筛选与先天性心脏病(CHD)相关的DACT1基因的错义突变,并研究其生物学功能.方法 研究对象为中国山东地区汉族人群,病例组为2008年8月至2011年1月散发CHD的连续就诊患儿,排除综合征型和有心脏病家族史患者;对照组为同时期收集的排除CHD以及有心脏病家族史的健康儿童.①提取两组外周静脉血WBC的基因组DNA,靶向DACT1基因的编码区进行测序,将测序结果中的单核苷酸变异(SNV)与数据库dbSNP(version137)和千人基因组比对,病例组与对照组的SNV比对,筛选出病例特异性的新发现或稀有DACT1突变位点,通过Sanger法验证.②构建野生型和各突变型DACT1的表达质粒,在HEK293T细胞中通过蛋白质免疫印迹实验观察DACT1和DVL2蛋白表达水平.③通过双荧光素酶报告基因实验观察突变后DACT1对经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路(PCP)调控作用的变化.结果 病例组404例,年龄(2.9±2.7)岁;对照组213名,年龄(7.1±3.7)岁.病例组和对照组的男女比例分别为1.2:1和1:1,均为汉族儿童.在3例CHD中筛选到4个DACT1基因编码区的新发现或稀有的错义突变c.1486C>T(p.S441L)、c.1598C>A(p.S478R)、c.1659G>C(p.E499Q)和c.1891T>A(p.M576K),经Sanger测序验证均为杂合突变.DACT1S478R和DACT1E499Q在不同物种中保守性很高.DACT1S441L SIFT评价为有害突变;DACT1E499Q PolyPhen-2评价为可能有害(0.978),DACT1S478R和DACT1M576K SIFT和PolyPhen-2预测为无有害性.4种突变型对DACT1蛋白的表达水平均无明显影响.与野生型DACT1相比较,突变型DACT1E499Q对DVL2蛋白的下调作用减弱(P<0.05),对经典Wnt信号通路以及PCP信号通路的抑制作用也减弱(P<0.01).结论 DACT1E499Q错义突变可能通过减弱对Wnt信号通路活性的抑制来促进CHD的发生.

目的 研究过表达DACT1通过调节凋亡相关蛋白对人白血病细胞增殖的抑制作用.方法 在人白血病K562细胞中,通过基因转染试剂对空载质粒vector与DACT1质粒分别进行转染,分别作为阴性对照组与观察组,并使DACT1呈现过表达.另设置一组未经任何处理的细胞为空白对照组.通过流式细胞术、CCK-8法对DACT1过表达后K562细胞周期、增殖、凋亡的影响进行检测.并采用Western blot法对DACT1过表达后调节凋亡相关蛋白的表达进行检测.结果 观察组克隆形成率为(6.33±0.98)％,较空白对照组(20.74±3.12)％、阴性对照组(20.43±3.32)％均明显降低(P<0.05).细胞增殖实验结果发现,观察组细胞增殖活性较空白对照组、阴性对照组均显著降低.观察组细胞凋亡率为(28.97±3.04)％,较空白对照组(0.85±0.12)％、阴性对照组(0.83±0.09)％均显著升高(P<0.05).观察组细胞G0/G1期比例较空白对照组、阴性对照组显著增加(P<0.05).观察组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等促凋亡蛋白表达较空白对照组和阴性对照组均显著上调,而B淋巴细胞癌-2(Bcl-2)等抗凋亡蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组均显著降低.结论 在人白血病K562细胞中,DACT1过表达可阻滞细胞增殖,促使细胞凋亡,亦会影响细胞周期,使得细胞出现G0/G1期阻滞.分析其原因,可能与DACT1过表达具有潜在的抗肿瘤作用,其作用机制可能与上调促凋亡蛋白(caspase-3、caspase-9、Bcl-2)表达和抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达密切相关.

目的:探讨青黄散联合健脾补肾方对骨髓增生异常综合征(MDS)患者DACT1基因甲基化及Wnt/β-catenin通路的影响.方法:亚硫酸氢盐测序法检测30例MDS患者治疗前后骨髓DACT1基因甲基化状态、RTPCR检测治疗前后DACT1 mRNA及β-catenin mRNA变化.结果:治疗前MDS骨髓标本中,DACT1基因启动子区S1片段呈高甲基化状态,为15.21％,经青黄散联合健脾补肾方治疗后呈低甲基化状态,为5.45％ (P＜0.01).治疗后DACT1 mRNA相对表达量由0.69±0.41升至1.83±2.01,较治疗前显著增加(P＜0.01);β-catenin mRNA相对表达量治疗前后差异无统计学意义.结论:青黄散联合健脾补肾方通过DACT1基因去甲基化的作用效应,可能主要通过激活下游其他通路实现抑癌作用.

本文报告用苯肼诱发小鼠网织红细胞形成过程中，光镜、电镜未见骨髓和外周血有裸核和排核过程，而观察到核分散、溶解于胞质内。经PI染色，用流式细胞光度仪测得网织红细胞DNA存在。用分离提纯的网织红细胞及分离弃线粒体的网织红细胞，从胞浆与胞膜用生化方法提取得DNA，经紫外分光光度仪和凝胶电泳分析表明网织红细胞DNA之分子量大于2.9763×10 7u，电镜观察其DNA为线性型和环型双链结构。 3H-DACT掺入实验，放射自显影和液闪仪测定结果皆表明网织红细胞摄入大量 3H-DACT，提示网织红细胞之DNA可能具有转录mRNA的功能活性。