微RNA(microRNAs,miRNAs)是一种与肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关的短序列非编码RNA,其具有丰度低、序列同源性高和易降解等特点,因此,miRNAs的高灵敏、高特异检测面临巨大挑战.具有RNA切割活性的脱氧核酶是新兴的一类功能性单链DNA分子,此类酶能在金属离子的辅助下对核酸底物特异性切割,释放miRNA进行循环再利用,实现信号放大.目前,基于脱氧核酶催化放大检测miRNA的新方法研究是近年来科研人员的重点关注方向之一.本文根据脱氧核酶结合不同的生物传感新技术和新材料,对近年来发展出的基于脱氧核酶催化放大检测miR-NAs 的新方法进行分类与回顾,归纳为脱氧核酶DNA自组装、脱氧核酶偶联等温扩增以及脱氧核酶结合新型纳米材料的3类方向,并逐一阐述各个方向的基本原理及其在生物传感领域、医学检测方向的最新研究进展与应用实例,旨在为进一步的精准灵敏检测miRNAs新策略研究提供参考.

目的 构建一种自催化发夹组装无酶信号放大的靶标快速荧光法,用于检测靶标miRNA.方法 首先在金纳米颗粒(AuNP)表面修饰5-羧基荧光素(FAM)标记的DNA发夹探针H1,形成探针AuNP-H1,H1的荧光被AuNP猝灭.加入靶标miRNA会导致AuNP上的H1标记荧光素远离AuNP而重新发射荧光,随后H1与DNA发夹探针H2发生循环自组装,靶标循环被利用,导致荧光信号放大.将探针AuNP-H1、探针H2及不同浓度的miRNA-721共反应后,在480 nm激发波长下测定体系的荧光强度.结果 以急性心肌炎生物标志物miRNA-721为模型靶标,在优化的实验条件下使用20 μL探针AuNP-H1、50 μL 3 μmol/L探针H2(退火缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2,pH 7.4)与 50 μL不同浓度(0.1～5 μmol/L)的 miRNA-721 在 30 ℃共反应20 min,发现在520 nm处的相对荧光强度变化值(△F=F-F0)与miRNA-721浓度(C)呈良好的线性关系,拟合线性方程为△F=29 232×lgC-52 435(R2=0.991 0).该荧光法检测限为1.23 nmol/L.在正常人血清中的加标回收率为92.71％～104.02％.一次完整的miRNA分析可以在20 min内完成.结论 该方法可用于生物样品中miRNA-721的检测,为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段.

目的:合成一种DNA纳米配位聚合物(Ca-pHis-Apt19S),并探讨其对骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell,BMSC)活性的影响.方法:通过贴壁筛选法从小鼠股骨干骺端提取并用流式细胞术表面抗原鉴定BMSC;利用细胞穿透肽聚组氨酸(polyhistidine,pHis)与BMSC适配体Apt19S共价链接,通过与钙离子配位自组装制备DNA纳米配位聚合物(Ca-pHis-Apt19S),以期用于提高BMSC活性.用不同质量浓度的Ca-pHis-Apt19S处理BMSC,采用CCK-8法、活/死细胞染色法和流式细胞术检测Ca-pHis-Apt19S对BMSC的活力和表型的影响;采用荧光共聚焦显微镜观察Ca-pHis-Apt19S对BMSC的靶向能力,同时通过CCK-8法研究Ca-pHis-Apt19S促进BMSC活性的主要成分.结果:成功合成了粒径为50～120 nm的球形DNA纳米配位聚合物Ca-pHis-Apt19S;合成的Ca-pHis-Apt19S可显著促进BMSC的活力(P＜0.05)且不影响其细胞凋亡和表面抗原的表达;共聚焦显微成像结果证实BMSC适配体Apt19S的组装能进一步提高细胞对Ca-pHis-Apt19S的摄取,而CCK-8实验结果显示,Ca-pHis-Apt19S中pHis能随着细胞摄取量的增加而进一步显著提高BMSC 的活力(P＜0.05).结论:Ca-pHis-Apt19S可在体外靶向BMSC并显著提高其生物活性而不改变其表型,为BMSC的体外培养提供一种新方法.

DNA纳米笼是由多条DNA寡核苷酸链通过碱基互补配对原则自组装而成的具有一定空间结构的纳米级多面体.研究表明,DNA纳米笼,尤其是DNA正四面体纳米笼,作为一种极具潜力的纳米载体,具有结构稳定、生物相容性好、易于穿透细胞膜、易于载药及表面修饰等优点.本文综述了DNA纳米笼的结构特性、合成方法、靶向修饰及其在纳米药物载体、生物成像、体外诊断和材料科学等方面的发展及应用.

目的 探讨RGD-GGG-K18多肽与融合双表达质粒pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP自组装纳米颗粒的抗肿瘤效果.方法 化学合成带有正电荷的RGD-GGG-K18多肽,以富含正电荷的RGD-GGG-K18多肽与质粒pIRES2-3×E7-HSP1 10-EGFP通过静电引力作用自我组装形成纳米颗粒.凝胶阻滞实验、透射电镜、DNaseⅠ保护实验和Western blot等方法对纳米颗粒进行鉴定.通过流式细胞术、体外特异性细胞毒释放实验分析疫苗诱导的免疫应答和其介导的CTL毒性效应.以TC-1细胞构建预防性及治疗性肿瘤模型,观察纳米颗粒疫苗在动物体内的抗肿瘤效应.结果 成功构建了RGD-GGG-K18/pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP纳米颗粒疫苗,确定最佳多肽/DNA电荷比r=2.0;当r=2.0时所制备的颗粒,大小均一,类圆形,绝大部分直径分布于50 nm左右.该纳米颗粒可将hHSP110基因导入肿瘤细胞,并在体外和体内均很大程度上提高了抗原表位特异性的免疫原性,诱导T淋巴细胞增殖,显著增强抗原特异性CTL应答及其产生的细胞毒效应.该纳米颗粒疫苗显著抑制了小鼠的肿瘤生长,延长其存活时间.结论 RGD-GGG-K18/pIRES2-3×E7-HSP 110-EGFP纳米颗粒疫能有效抑制宫颈癌的发生和发展.

DNA折纸技术是近年来新提出的一种DNA自组装方法,可设计特定的DNA序列,遵循碱基互补配对原则来构建出更为复杂的纳米结构与纳米图案.近期发现通过DNA折纸技术构建出的DNA四面体纳米结构(TDN)在干细胞领域有着巨大应用潜能.本文就TDN结构、生物学特性以及在干细胞领域的应用进行综述.

背景:研究表明,肝脏细胞外基质水凝胶可促进肝脏特异性细胞的行为更加接近体内的状态,可增强肝细胞的活性及功能,促进内皮细胞的血管化和胆管上皮细胞的胆管化,但对于肝脏基质胶本身性质的研究较少.目的:采用温和去细胞技术制备肝脏细胞外基质水凝胶,并对水凝胶进行初步表征.方法:取新鲜冰冻的猪肝组织切片,常温下放入去离子水中搅拌4次;移入预热到37℃的0.02％胰酶/0.05％EDTA溶液中,37℃搅拌1h,去离子水清洗肝片,放入3％Triton X-100溶液中搅拌1.5 h;去离子水冲洗肝片,放入4％脱氧胆酸钠溶液中搅拌1.5 h;过量去离子水冲洗肝片,获得去细胞肝脏支架;将肝脏支架移入0.1％过氧乙酸溶液中搅拌2.0-3.0h,置入1×PBS溶液中搅拌15 min、去离子水中搅拌浸泡2次、1×PBS冲洗15 min;再通过冻于、液氮研磨、消化成肝脏基质溶液,经过后续的配平,多肽分子自组装成肝脏细胞外基质水凝胶.检测肝脏细胞外基质水凝胶的脱细胞程度、DNA含量、组成成分、浊度动力学及微观结构.结果 与结论:①采用温和脱细胞技术得到了脱细胞肝脏支架,而且脱细胞较完全;②脱细胞肝脏支架的DNA含量较正常肝脏组织明显下降(P＜0.001);③肝脏细胞外基质水凝胶前体溶液保留了许多猪肝细胞外基质成分,比如胶原蛋白、弹性蛋白、糖安聚糖及其前体等;④浊度动力学实验显示,随着肝脏细胞外基质凝胶质量浓度的增大,平台期的吸光度值升高;⑤扫描电镜显示,肝脏细胞外基质水凝胶呈现纤维网状多孔结构,纳米级细胞外基质纤维互相交错,并且随着肝脏细胞外基质水凝胶质量浓度的增加,纤维密度相对增加,直径无变化;⑥结果表明,采用温和去细胞技术制备的肝脏细胞外基质水凝胶,具有三维立体网络结构,为细胞的黏附、生长提供了结构基础.

目的 探究虾青素/天然DNA/壳聚糖纳米粒(Ast/DC)对紫外诱导的小鼠皮肤光老化的改善作用.方法 分子自组装结合溶剂蒸发法制备Ast/DC.紫外照射脱毛小鼠30 d模拟皮肤光老化,研究Ast/DC对小鼠皮肤表观形态、组织纤维结构以及皮肤中超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化因子表达水平等的影响;并用Franz扩散池模拟透皮吸收过程研究纳米载体对虾青素的经皮递送效果.结果 将平均粒径为266 nm、Zeta电位为32.7 mV的Ast/DC(虾青素有效剂量为1.5 μg·cm-2·d-1)涂抹于紫外照射小鼠的背部,可维持其皮肤正常形态和结构,在角质层厚度、胶原纤维和弹性纤维结构等方面与未经紫外照射小鼠相比无明显差异;并且皮肤组织中的谷胱甘肽(GSH)、SOD和过氧化氢酶(CAT)表达水平较光老化小鼠分别显著提高31.4％、25.1％和41.7％(P＜0.05).当虾青素有效涂抹剂量低至0.33 μg·cm-2·d-1时,Ast/DC仍能显著提高皮肤组织中的抗氧化因子表达水平,且优于游离虾青素;相较于光老化模型小鼠,低剂量Ast/DC组小鼠和虾青素油(Ast/oil)组小鼠中GSH含量分别提高26.4％和15.1％.同时,Ast/DC的24 h累积透皮吸收量比游离虾青素提高20.7％.结论 Ast/DC能有效保护小鼠皮肤,抵御紫外照射引起的皮肤光老化.

目的 将纳米银运载紫杉醇(PTX),以促进PTX进入细胞,评价其对肺癌A549细胞的细胞毒性及作用机制.方法 透射电镜(TEM)检测自组装表面功能化纳米银(Ag@PTX)粒径大小,MTT实验检测Ag@PTX对A549细胞的细胞毒性,细胞周期实验和DNA片段化改变用于检测A549细胞凋亡.结果 透射电镜像结果表明Ag@PTX粒径小(2～2.5 nm)且稳定性好;MTT实验结果发现该纳米系统对A549细胞的细胞毒性高于正常细胞,A549细胞组存活率分别为65％、26％及13％,HK-2细胞存活率分别为97％、95％及94％,对A549细胞生长有选择性抑制作用.细胞周期分析、DNA片段化改变实验证实Ag@PTX抑制A549细胞生长是通过诱导细胞凋亡路径.结论 Ag@PTX诱导A549细胞凋亡是抑制其生长的机制之一,Ag@PTX可能成为一种新的化疗药物候选.

目的 构建纳米自组装短肽RADA16-Ⅰ三维细胞培养模型,探讨卵巢癌细胞A2780三维培养的可能性.方法 采用透射电镜观察细胞支架材料结构特征;MTT比色法观察细胞粘附情况;通过荧光显微镜和DNA含量测定检测细胞生长情况;免疫组化法检测细胞粘附分子(整合素β1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白)表达情况;ELISA检测细胞相关因子(VEG-FA、EGF、FGF2、IGF1)表达水平;活性氧检测法检测支架材料中细胞氧活性情况.结果 与Matrigel和Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)相比,纳米自组装短肽RADA16-Ⅰ具有较长纤维,且形成的纤维网架结构较为密集;A2780对短肽RADA16-Ⅰ的粘附力相似于Matrigel、Collagen Ⅰ(P＞0.05);三维培养第3天A2780开始聚集成团且活性良好,在RADA16-Ⅰ中细胞增殖相对Matrigel与Collagen Ⅰ较慢,但保持一定增殖速率;在RADA16-Ⅰ三维培养体系中,细胞氧活性良好,且细胞粘附分子(整合素β1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白)和细胞相关因子(VEGFA、EGF、FGF2、IGF1)均有表达.结论 纳米自组装短肽RADA16-Ⅰ可成为体外A2780研究的三维实验模型.