目的 探讨整合素亚单位α3(ITGA3)对非小细胞肺癌(NSCLC)紫杉醇耐药性的影响及机制.方法 选取行紫杉醇联合顺铂化疗的50例NSCLC患者肿瘤组织及A549/Tax(人肺腺癌紫杉醇耐药性)细胞、人A549细胞株及人胚胎肺成纤维细胞(MRC-5),RT-qPCR法检测组织及细胞中ITGA3基因mRNA表达;以A549/Tax细胞为研究对象,分别转染pcDNA3.1-ITGA3质粒(oe-ITGA3)及pcDNA3.1空载体(oe-NC)、沉默ITGA3小RNA(sh-ITGA3)及阴性对照(sh-NC),标记为oe-ITGA3组、oe-NC组、sh-ITGA3组、sh-NC组,同时以未经处理的A549/Tax细胞为对照组;CCK-8 法检测 24、48 h的OD450 值;Western blotting法检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白[波形蛋白(Vimentin)、钙黏附蛋白E(E-cadherin)、snail]及转化生长因子β(TGF-β)、免疫逃逸蛋白[程序性死亡分子配体1(PD-L1)]表达;RT-qPCR法检测A549/Tax细胞中ITGA3 mRNA表达;Transwell实验检测A549/Tax细胞迁移、侵袭能力.结果 治疗后肿瘤组织中ITGA3 mRNA表达高于治疗前肿瘤组织(P<0.05),A549细胞、A549/Tax细胞中ITGA3 mRNA表达高于MRC-5细胞(P均<0.05).治疗后,NSCLC患者肿瘤组织中Vimentin、snail、TGF-β、PD-L1较治疗前增加,E-cadherin降低(P均<0.05).与对照组、oe-NC组相比,oe-ITGA3组24、48 h的OD450值、细胞迁移、侵袭数目、ITGA3 mRNA、Vimentin、snail、TGF-β、PD-L1表达增加,E-cadherin表达降低(P均<0.05);与对照组、sh-NC组相比,sh-ITGA3组24、48 h OD450 值、细胞迁移、侵袭数目、ITGA3 mRNA、Vimentin、snail、TGF-β、PD-L1表达降低,E-cadherin表达增加(P均<0.05).结论 下调ITGA3表达可抑制NSCLC细胞对紫杉醇的耐药性,其机制可能与抑制TGF-β表达有关.

目的:构建表达结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis， Mtb)潜伏期表达抗原Rv3133c，通过人群以及小鼠实验评价其免疫原性。 方法:构建重组质粒pPROEX-Rv3133c，诱导表达并纯化蛋白质，经Western blot鉴定后，用全血干扰素释放试验评价重组蛋白rRv3133c在 Mtb感染人群中的免疫原性；联合佐剂DC免疫小鼠，检测小鼠血清中rRv3133c特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平以及脾细胞中多功能T细胞免疫应答水平和肺脏组织细胞因子mRNA表达水平。 结果:成功构建表达rRv3133c。rRv3133c可刺激 Mtb感染者尤其是潜伏感染者产生高水平的IFN-γ。免疫小鼠后，rRv3133c+DC组小鼠脾脏IFN-γ、TNF-α、IL-2水平，以及IFN-γ +TNF-α +CD4 +T细胞数量和肺脏组织中抗原特异性IFN-γ、TNF-α、iNOS的mRNA表达水平均高于BCG组，但低于BCG+rRv3133c+DC组；rRv3133c+DC组和BCG+rRv3133c+DC组小鼠血清中IgG2a/IgG1比值均大于1，显著高于BCG组。 结论:rRv3133c具有良好的免疫原性，可以诱发机体产生较强的Th1型免疫应答，是结核病亚单位疫苗的潜在候选靶抗原。

目的 探讨丹参水提物对肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS)的作用及机制.方法 以野百合碱诱导大鼠HSOS,给予丹参水提物后,通过血清生化指标检测、肝脏病理切片观察以及肝组织基质金属蛋白酶9(metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达测定,评价丹参水提物对HSOS的抑制作用.通过TCMSP、HERB与GeneCards等数据库交联分析,获取丹参水提物抑制HSOS的关键靶点,并应用STRING与DAVID等数据库富集信号通路;进一步采用qRT-PCR与Western blotting对数据库结果予以验证.结果 与模型组比较,丹参水提物可显著抑制野百合碱诱导的大鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)活力(P＜0.05、0.01),降低肝脏MMP-9蛋白表达(P＜0.05),并改善肝窦充血、中央静脉内皮脱落、Ⅲ区肝细胞坏死等病变.网络药理学分析筛选得到核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)、核因子-κBp65(nuclear factor-κB p65,NF-KBp65)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β以及一氧化氮合酶2(nitricoxide synthase 2,NOS2)等关键基因,京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析结果表明,以上靶基因主要富集于活性氧(reactive oxygen species,ROS)、TNF和NF-κB等信号通路.丹参水提物可降低野百合碱诱导的丙二醛(malondialdehyde,MDA)和ROS含量(P＜0.05、0.01),减少F4/80、Ly6G阳性细胞浸润数目(P＜0.05、0.01),诱导Nrf2核转位(P＜0.01),促进谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位(catalytic subunit of glutamate-cysteine ligase,GCLC)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM)、HO-1及醌氧化还原酶 1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)等基因的表达(P＜0.05、0.01、0.001),升高 GCLC、GCLM、HO-1 蛋白表达水平(P＜0.05、0.001);并抑制 NF-κB 核转位(P＜0.001),降低 TNF、IL-1β、IL-6、NOS2、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因表达(P＜0.05、0.001),升高 TNF-α、IL-1β、磷酸化NF-κB抑制蛋白(phosphorylated inhibitor of NF-κB,p-IκB)蛋白表达水平(P＜0.05、0.001).结论 丹参水提物可通过激活Nrf2抗氧化信号通路,抑制NF-κB炎性信号通路,而抑制野百合碱诱导的HSOS.

目的 探究人重组神经调节蛋白1(NRG-1)对急性视神经损伤大鼠模型视网膜神经节细胞(RGCs)存活的保护作用及可能的机制.方法 通过动脉夹夹持法建立视神经损伤大鼠模型,大鼠随机分为假手术组、模型组、NRG-1(0.5 μg、1.0 μg、3.0 μg)组.NRG-1组大鼠术后30 min于玻璃体内分别注射0.5 μg、1.0 μg、3.0 μg人重组NRG-1,其余大鼠以同样的方式注射等量生理盐水.通过闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测术后2 h、1 d、2 d、7 d、14 d、28 d大鼠视神经P100波潜伏期和波幅的变化;术后28 d,通过霍乱毒素亚单位(CTB)示踪视网膜受压状态;另外采用TUNEL法检测视网膜和视神经组织中RGCs凋亡情况,酶联免疫吸附试验检测视神经组织中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β),免疫组化法检测NRG-1蛋白表达,Western blot法检测Nrf2、HO-1、Bach1蛋白表达.结果 术后28 d,与假手术组相比,模型组P100波潜伏期延长,波幅降低,视网膜和视神经组织中RGCs凋亡数量增加,视神经组织中TNF-α、IL-1β、NO、MDA水平升高,且总蛋白HO-1、核蛋白Nrf2和Bach1蛋白表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05);而与模型组相比,NRG-1 1.0 μg组和3.0 μg组P100波潜伏期缩短,波幅升高,视网膜和视神经组织中RGCs凋亡数量减少,视神经组织中TNF-α、IL-1β、NO、MDA水平降低,总蛋白HO-1、核蛋白Nrf2和Bach1蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05);而NRG-1 3.0 μg组大鼠P100波潜伏期和波幅,RGCs和神经胶质细胞凋亡数量,视神经组织中TNF-α、IL-1β、NO、MDA水平与假手术组相比,差异无统计学意义(P>0.05).结论 NRG-1蛋白在大鼠急性视神经损伤后期表达明显降低,而给予外源性人重组NRG-1能够通过抑制视网膜RGCs凋亡以及激活Nrf2/HO-1/Bach1通路发挥抗炎、抗氧化作用,从而实现对视神经损伤的修复和保护作用.

目的 研究视网膜色素上皮细胞(RPE)主要是通过何种亚型的腺苷受体(ARs)来结合腺苷,及其对RPE功能的影响.方法 体外培养人ARPE-19细胞系,定量PCR检测4种腺苷受体(ARA1、ARA2A、ARA2B、ARA3)基因的表达;提取细胞膜蛋白,Western blot检测4种腺苷受体在RPE细胞膜上的存在.体外培养ARPE-19细胞至80％融合后随机分为A～E组.其中,A组为无干预对照组,B～E组分别给予ARA1拮抗剂DPCPX(50 nmol/L)、ARA2A拮抗剂SCH58261(100 nmol/L)、ARA2B拮抗剂MRS1754(100 nmol/L)及ARA3拮抗剂MRS1220(5μmol/L)干预.利用H3-腺苷进行放射性配体结合实验,计算各组细胞对腺苷的最大结合容量(Bmax).以肿瘤坏死因子α(TNF-α)10μg/L及γ干扰素(IFN-γ)1000 U/mL联合干预体外培养的ARPE-19细胞,给予或不予ARA1激动剂(CCPA),酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清中白细胞介素(IL)-6、IL-10、转化生长因子β(TGF-β)、单核细胞趋化因子(MCP)-1、趋化因子C-X-C配体10(CXCL10,IP-10)的含量.结果 在ARPE-19细胞中即可检测到4种腺苷受体基因的表达,也可探测到其分子在细胞膜上的存在.A～E组ARPE-19细胞结合腺苷的Bmax(单位:fmol)分别为2.04±0.31、0.44±0.06、1.82±0.28、2.01±0.42及2.06±0.44,其中B组较其他各组Bmax均降低(P<0.01).以TNF-α及IFN-γ激活ARPE-19细胞,与对照RPE组比较,CCPA干预RPE组IL-6、MCP-1及IP-10的含量降低、IL-10的含量增加(P<0.01).2组TGF-β的含量差异无统计学意义.结论 ARA1对ARPE-19细胞结合腺苷的能力具有重要的调控作用,ARA1受体介导的信号可抑制ARPE-19细胞分泌促炎因子及驱化因子,具有潜在的免疫抑制作用.

目的:山姜素或豆蔻明为药食同源植物草豆蔻中的两种主要活性组分,鉴定分析这两种活性组分与人血浆相互作用后的差异显示蛋白.方法:在模拟生理条件下,应用双向电泳技术进行蛋白分离,通过基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱分析及Mascot Distiller软件进行蛋白搜库.结果:获得山姜素或豆蔻明与人血样相互作用后的10个差异显示蛋白,经质谱鉴定为8种蛋白,分别是补体B因子、1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白E、间α胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白、人类补体成分补体3(C3c)、阿尔法1-抗蛋白酶、类型Ⅱ角质亚单位蛋白、游离型人类载脂蛋白A-Ⅰ.结论:这些差异蛋白与机体防御、增强免疫效应、蛋白代谢、抑制吞噬细胞活性、增加白细胞数目、保持载脂蛋白游离构象等生理过程密切相关,也从一定程度上说明了山姜素或豆蔻明的抗菌抗炎机理及可能的靶蛋白.

目的 通过比较不同来源的 H5N1甲型流感病毒 H5血凝素蛋白生物信息学,分析 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的分子特征.方法 从Gene Bank基因数据库中获取15株H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的核苷酸和氨基酸序列,采用在线软件SignalP4.1预测信号肽,运用Clustal X,Bioedit等国际通用软件进行氨基酸和核苷酸的序列比对,计算核苷酸及氨基酸的同源性.在线软件 Antheprot分析二级结构.结果 15株 H5血凝素蛋白编码框架长约1707 bp(8株)/1704 bp(7株),编码含568个/567个氨基酸组成的多肽.H5血凝素氨基酸同源性为86.7%~99.2%,核苷酸同源性为85.6%~99.5%,H5血凝素蛋白富含潜在α螺旋(29%~35%)、β折叠(22%~25%)和卷曲结构(22%~25%)等二级结构.H5血凝素蛋白 aa1-aa16区域为潜在信号肽,血凝素蛋白 A1和 A2裂解序列为 aa323-aa333之间的 RERRRKKR↓GLF 序列,切割位点位于 R330和 G331之间;H5血凝素蛋白 A1亚单位存在4个高变区,分别是aa115-aa140(52.0%)、aa151-aa170(57.9%)、aa183-aa200(64.7%)和aa263-aa280(47.4%).但参与二硫键形成的10个半胱氨酸位点均未发生变异;构成受体结合域的 E186、K212、S217-K218、G221-Q222-S223-G224等位点较保守;构成T细胞和B细胞表位 aa141-155、aa206-223和 aa302-316等区域较保守.结论 H5N1甲型流感病毒 H5血凝素蛋白的受体结合域和免疫表位等重要功能结构域的序列比较保守稳定,在 A1和 A2裂解位点含高致病禽流感病毒分子特征相关的连续6个碱性氨基酸(R/K)序列.

目的:观察针刺对阿尔茨海默病(AD)模型快速老化小鼠亚系8 (SAMP8)小鼠海马线粒体蛋白质组表达的影响,探寻针刺对线粒体发挥保护作用的可能机制.方法:将60只6月龄雄性SAM P8小鼠随机分为穴位针刺组、非穴位针刺组及模型组,每组20只;另20只同月龄雄性抗快速老化小鼠亚系1(SAMR1)小鼠作为正常组.针刺组选取肾俞、百会、血海、膈俞进行针刺干预.干预8星期后,提取海马线粒体组织,采用亚细胞器蛋白质组学技术鉴定差异蛋白质点,Western blot验证部分相关差异蛋白质在海马线粒体中的表达.结果:与模型组相比,穴位针刺组最终得到鉴定的有13个差异蛋白质点,其中9个上调,包括神经丝轻链多肽(NFL),肌动蛋白胞质型1(数据库ID:ACTB),微管蛋白乙2A链(TBB2A),原肌球调节蛋白2(TMOD2),丙酮酸脱氢酶E1β亚单位(PDHE1-β),NADH-泛醌氧化还原酶75 kDa亚基(数据库ID:NDUS1),热休克同源物71 kDa蛋白(HSC71),丙酮酸脱氢酶E1α亚单位(PDHE1-α)和ATP合成酶β亚基(ATP-β);4个下调,包括胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP),丙酮酸脱氢酶磷酸酶1(PDP1),线粒体加工肽酶α亚基(MMP-α)和腺苷激酶(ADK).根据蛋白质数据库中提供的相关信息,绝大部分差异蛋白质点主要涉及线粒体功能以及结构的调节.正常组及穴位针刺组的NFL、TBB2A表达水平明显高于非穴位针刺组(P＜0.05);穴位针刺组的ATP-β、NDUS1表达水平明显高于非穴位针刺组(P＜0.05);非穴位针刺组与模型组无明显差别(P＞0.05).结论:针刺可能是通过调节海马神经元线粒体的结构和功能蛋白来实现对AD的潜在治疗作用.

目的 探讨1例经典型枫糖尿症(maple syrup urine disease,MSUD)患儿的遗传学病因.方法 采用二代高通量测序技术对新生儿疾病筛查诊断的1例经典型MSUD患儿BCKDHA基因的9个外显子、BCKDHB基因的10个外显子、DBT基因的11个外显子和DLD基因的14个外显子进行序列捕获和测序,确定可疑的突变位点,并用Sanger测序技术进行双向验证和父母验证.应用计算机软件预测突变位点氨基酸进化保守性和突变导致蛋白质结构及功能的变化,分析突变位点的变异性质.结果 高通量测序发现患儿BCKDHB基因存在第5外显子c.550delT缺失突变和第10外显子c.1046G＞A错义突变;未检测到BCKDHA基因、DBT基因、DLD基因的突变.Sanger测序验证了高通量测序的结果.患儿父亲携带BCKDHB基因c.1046G＞A杂合突变.母亲携带BCKDHB基因c.550delT杂合突变.c.1046G＞A错义突变为已报道过的突变,c.550delT突变为未报道过的新突变.两个突变均涉及高度保守的位点,突变导致支链酮酸脱氢酶复合体(branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex,BCKD) E1β亚单位一级、二级结构及功能结构域明显改变,BCKD活性降低.结论 BCKDHB基因c.550delT和c.1046G＞A复合杂合突变为该经典型MSUD患儿的遗传学病因,c.550delT突变的检出丰富了BCKDHB基因的突变谱.

目的 探讨鸦胆子苦醇对雌性生殖细胞减数分裂启动及早期卵子发生的影响.方法 6～8周小鼠雌雄合笼,以雌性小鼠见阴栓记为胚胎0.5 d(E0.5).收集E11.5、E12.5、E13.5、E14.5的雌性胎鼠生殖嵴,分别通过qRT-PCR及Western blotting检测核因子E2(NF-E2)相关因子2(Nrf2)mRNA及蛋白水平.分离E12.5雌性胎鼠的生殖嵴,分别用二甲基亚砜(对照组)、10 nmol/L、20 nmol/L的Nrf2抑制剂——鸦胆子苦醇、1 μmol/L视黄酸或20 nmol/L鸦胆子苦醇+1 μmol/L视黄酸处理48 h后,检测Nrf2通路、减数分裂启动、视黄酸信号通路相关基因的mRNA水平.药物处理48 h后继续培养10d,对体外培养的生殖嵴行石蜡切片和HE染色进行原始卵泡计数.结果 与对照组相比,10 nmol/L、20 nmol/L的鸦胆子苦醇显著下调减数分裂启动关键基因Stra8、Sycp3及Daz1的mRNA水平(P＜0.05).与对照组的单位面积卵泡数量(151.1±6.8)相比,10 nmol/L、20 nmol/L组的单位面积原始卵泡数量显著减少(109.5±12.2,49.1±8.0)(P＜0.01).与对照组相比,20 nmol/L鸦胆子苦醇显著抑制视黄酸合成酶(P=0.001)及其受体(P=0.049)的表达.添加视黄酸能部分挽救鸦胆子苦醇对基因Raldh、RARa(P＜0.01)及基因Stra8、Sycp3及Dazl的表达抑制作用(P＜0.01).结论 鸦胆子苦醇通过抑制Nrf2通路调控减数分裂启动及早期卵子发生.