目的:探索牙龈卟啉单胞菌（Pg）持留菌（Ps）对巨噬细胞免疫炎症反应的影响及其作用机制。方法:将Pg（ATCC 33277）悬浮培养和生物膜培养至对数末期（72 h）后，不使用药物处理以及使用高浓度甲硝唑（100 mg/L）和（或）阿莫西林（100 mg/L）处理不同时间，分别为空白对照组、甲硝唑组、阿莫西林组、甲硝唑+阿莫西林组，采用血平板计数法检测Ps生成数量，细菌活死染色检测Ps的生存状态；使用Pg和甲硝唑处理的PgPs（M-PgPs）刺激巨噬细胞，分别为空白对照组（不经任何处理）、Pg组、M-PgPs组；通过透射电镜观察细菌进入细胞内部的情况；使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测巨噬细胞内炎症相关指标的表达情况；通过RT-qPCR检测巨噬细胞叉头盒转录因子1（FOXO1）信号通路的激活情况；利用共聚焦免疫荧光显微镜检测FOXO1在巨噬细胞内的分布情况。使用FOXO1抑制剂（Fi）和激活剂（Fa）处理巨噬细胞后，用Pg和M-PgPs刺激巨噬细胞，分别为空白对照组（不经任何处理）、Pg组、M-PgPs组、Fi组、Fi+Pg组、Fi+M-PgPs组、Fa组、Fa+Pg组和Fa+M-PgPs组，通过RT-qPCR和ELISA法检测巨噬细胞内炎症相关指标的表达情况。结果:悬浮培养和生物膜中的Pg经过高浓度的甲硝唑和（或）阿莫西林处理后，均无法被完全杀灭，且存活的Ps可重新生长形成菌落；Pg和M-PgPs均可进入巨噬细胞内部且巨噬细胞中的炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的蛋白表达量［Pg组分别为（2 392±188）、（162±29）、（5 558±661）、（789±155）μg/L；M-PgPs组分别为（2 415±420）、（155±3）、（5 732±782）、（821± 176）μg/L］均显著高于空白对照组［分别为（485±140）、（21±9）、（2 332±87）、（77±7）μg/L］（均 P<0.01）。同时，Pg和M-PgPs均可促进巨噬细胞内FOXO1入核，巨噬细胞内FOXO1信号通路相关基因FOXO1、B细胞淋巴瘤6和Krüppel样转录因子2 mRNA的相对表达量均显著高于空白对照组（均 P<0.05）。另外，Fi+Pg组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达量［分别为（1 081±168）、（70±8）、（1 976±544）、（420±47）μg/L］均显著低于Pg组［分别为（4 411±137）、（179±6）、（5 161±929）、（934±24）μg/L］（均 P<0.05）；Fi+M-PgPs组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达量［分别为（1 032±237）、（74±10）、（1 861±614）、（405±32）μg/L］均显著低于M-PgPs组［分别为（4 342±314）、（164±17）、（4 438±1 374）、（957±25）μg/L］（均 P<0.05）。相反，Fa+Pg组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白表达量［分别为（8 198±1 825）、（431±28）、（8 919±650）、（2 186±301）μg/L］以及Fa+M-PgPs组蛋白表达量［分别为（8 159±2 627）、（475±26）、（8 995±653）、（2 255±387）μg/L］均显著高于Pg组和M-PgPs组（均 P<0.05）。 结论:PgPs对甲硝唑和阿莫西林表现出高度耐药性；M-PgPs通过上调FOXO1信号通路诱发巨噬细胞的免疫炎症反应，该作用与未经药物处理的Pg无显著差异。

目的:探讨三氧化二砷（As 2O 3）诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）凋亡及叶酸（FA）和维生素B 12（VB 12）的保护作用。 方法:体外培养SH-SY5Y细胞，采用成组设计分为6组：对照组（正常培养）、砷暴露组（10.00 μmol/L As 2O 3）、FA干预组（0.30 mmol/L FA + 10.00 μmol/L As 2O 3）、VB 12干预组（0.06 mmol/L VB 12 + 10.00 μmol/L As 2O 3）、联合干预组（0.30 mmol/L FA + 0.06 mmol/L VB 12 + 10.00 μmol/L As 2O 3）及试剂对照组（0.30 mmol/L FA + 0.06 mmol/L VB 12），各组细胞培养24 h（ n = 3）。通过流式细胞仪测定各组细胞凋亡率；透射电镜观察细胞超微结构变化；实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹分别检测细胞凋亡相关指标B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）及Bcl-2相关X蛋白（Bax）的mRNA和蛋白表达情况；发光法检测细胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）3活性，并对以上指标进行统计分析。 结果:各组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（ F = 213.036， P < 0.05）。砷暴露组细胞凋亡率[（44.43 ± 3.54）%]高于对照、FA干预、VB 12干预、联合干预组[（1.80 ± 0.06）%、（14.37 ± 0.13）%、（19.10 ± 1.56）%、（17.11 ± 2.34）%， P均< 0.05]。透射电镜下可见砷暴露组SH-SY5Y细胞凋亡小体增多、线粒体肿胀变性、染色质凝集等，FA和VB 12单独及联合干预后细胞形态及细胞器改变明显改善。各组间细胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（ F = 5.178、7.169，6.142、9.194， P均< 0.05）。砷暴露组Bcl-2蛋白表达水平低于对照组（ P < 0.05），Bax mRNA和蛋白表达水平均高于对照组（ P均< 0.05）；FA干预和联合干预组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平均高于砷暴露组（ P均< 0.05），VB 12干预组Bcl-2 mRNA表达水平高于砷暴露组（ P < 0.05）；FA干预、VB 12干预和联合干预组Bax mRNA和蛋白表达水平均低于砷暴露组（ P均< 0.05）。各组间细胞Caspase 3活性比较，差异有统计学意义（ F = 84.604， P < 0.05）。砷暴露组细胞Caspase 3活性高于对照、FA干预、VB 12干预、联合干预组（ P均< 0.05）。 结论:砷暴露可导致SH-SY5Y细胞凋亡及超微结构改变，FA和VB 12可能通过调控Bcl-2/Bax途径、降低Caspase 3活性抑制细胞凋亡，在分子水平上发挥对神经细胞的保护作用。

目的:探讨遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia，HSP)家系的临床及遗传学特征。方法:收集5个HSP家系患者的临床资料，应用高通量测序法筛查、Sanger测序法验证基因变异位点。结果:家系1、2的先证者 SPAST基因分别存c.1196C>T杂合变异、c.1523T>A杂合变异；家系3先证者 FA2H基因存在c.61G>C和c.688G>A复合杂合变异；家系4先证者 SPG11基因剪接区存在c.6812＋4_6812＋7delAGTA和c.915delT复合杂合变异；家系5先证者 SPG7基因存在c.1703_1704delAG和剪接区c.1937-1G>C复合杂合变异。通过美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南评估，这些变异均为可能的致病变异。其中 SPAST基因c.1523T>A、 FA2H基因c.61G>C、 SPG11基因剪接区c.6812＋4_6812＋7delAGTA、c.915delT、 SPG7基因c.1703_1704delAG及剪接区c.1937-1G>C变异均为未报道过的新变异。 结论:家系1、2为常染色体显性遗传性痉挛性截瘫4型，其中家系2为不完全外显；家系3、4、5分别为常染色隐性遗传性痉挛性截瘫35型、11型、7型。上述发现为HSP的临床诊断及遗传咨询提供了依据。

目的:观察聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂尼拉帕利及帕米帕利对乳腺癌MCF-7及MDA-MB-436细胞放射敏感性的影响，并对其机制进行探讨。方法:将乳腺癌MCF-7及MDA-MB-436细胞分为空白对照组、尼拉帕利组、帕米帕利组、单纯照射组、尼拉帕利联合照射组、帕米帕利联合照射组。CCK-8法检测药物对细胞增殖的影响，克隆形成实验检测药物对细胞放射敏感性的影响，流式细胞术分析药物联合照射对细胞周期和凋亡的影响，免疫荧光法检测细胞内γ-H2AX焦点数量的变化，qPCR法及Western blot实验检测细胞中FANCG、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达。结果:尼拉帕利及帕米帕利均能抑制乳腺癌MCF-7及MDA-MB-436细胞的增殖，呈时间-剂量依赖性。随着照射剂量的增加，两种细胞的放射生物学参数 D0、 Dq、 SF2逐渐减小，而放射增敏比SER D0、SER Dq逐渐增大。尼拉帕利联合照射组及帕米帕利联合照射组与空白对照组相比，G 2/M期比例增加( tMCF-7＝41.66、44.08， P<0.05； t436＝24.69、18.91， P<0.05); G 0/G 1期比例减少( tMCF-7＝8.67、29.61， P<0.05； t436＝26.39、29.12， P<0.05)；细胞凋亡率显著增加( tMCF-7＝11.17、11.71， P<0.05； t436＝42.68、15.89， P<0.05)。与空白对照组相比，MCF-7细胞的单纯照射组、尼拉帕利联合照射组在射线照射后2 h，细胞核内γ-H2AX焦点数量显著增加( t＝8.89、21.72， P<0.05)；照射后24 h单纯照射组细胞核内γ-H2AX焦点数量基本恢复照射前水平，而尼拉帕利联合照射组细胞核内γ-H2AX焦点数量仍大量存在( t ＝8.82， P<0.05)。尼拉帕利联合照射组与空白对照组比较，MCF-7细胞的FANCG、Bcl-2 mRNA表达明显减少( tFANCG＝14.07， P<0.05； tBcl-2＝29.21， P<0.05)；Bax mRNA表达明显增多( t＝8.90， P<0.05)；与空白对照组相比，尼拉帕利联合照射组MCF-7细胞的FANCG、Bcl-2蛋白水平显著下降( tFANCG＝7.09， P<0.05； tBcl-2＝10.24， P<0.05)；Bax蛋白水平显著升高( t＝2.90， P<0.05)。 结论:PARP抑制剂尼拉帕利及帕米帕利能增加乳腺癌MCF-7及MDA-MB-436细胞的放射敏感性，其机制可能与下调FA-BRCA通路中FANCG的表达，调节凋亡相关基因，抑制DNA损伤修复有关。

目的:报道8例遗传性痉挛性截瘫35型（SPG35）患者，总结SPG35的临床及遗传学特点。方法:对2006年9月至2021年6月就诊于上海交通大学附属第六人民医院和上海交通大学医学院附属瑞金医院的8例SPG35患者进行临床资料采集、体格检查、影像学检查、全外显子测序、一代测序和家系共分离验证，并进一步对该疾病的临床、遗传学和发病机制作一总结。结果:8例先证者中7例为幼年起病，1例为成年起病，临床均表现为进行性加重的行走困难。其中2例临床表现为单纯型痉挛型截瘫，余6例不仅有运动系统功能的损害，还伴有认知功能障碍和吞咽困难等其他表型。基因检测共发现了13个脂肪酸2-羟化酶（FA2H）基因（NM_024306）突变，其中6个为已知突变，7个为本文新报道突变。结论:SPG35是一种常染色体隐形遗传的神经系统退行性疾病，其致病基因为FA2H基因，临床表现存在一定的异质性，基因型与表型相关性尚不十分明确。

目的 探究范科尼贫血(Fanconi anemia,FA)通路中的FANCM(FA complementation group M)基因及其突变在早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)发生中的致病机制.方法 对1例POI患者进行了全外显子组测序,并通过Sanger测序对突变位点进行验证.构建含有野生型和突变型FANCM基因的质粒,分别转染至293T细胞中,转染野生型人类 FANCM质粒、突变型人类FANCM 质粒、pEGFP-C1空载体质粒的293T细胞分别命名为EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组和EGFP组.对于截短蛋白的验证,3组质粒转染48 h后提取细胞蛋白,使用GFP抗体进行验证.对于DNA损伤修复影响的研究,免疫荧光实验在EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组293T细胞质粒转染48 h后进行,以研究该突变是否会影响FANCM定位于染色质的能力;利用丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)在体外诱导EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组293T细胞链间交联(interstrand crosslinks,ICLs)损伤的形成,然后使用γ-H2AX抗体验证其对ICLs损伤修复的影响.结果 在1例近亲婚配家系的POI患者中,我们发现了FANCM基因c.1152-1155del:p.Leu386Valfs*10的纯合突变.Western blot结果表明,该突变导致截短的FANCM蛋白产生.在丝裂霉素C处理后,与EGFP FANCM-WT组相比,EGFP FANCM-MUT组293T细胞中γ-H2AX水平升高(P<0.01).免疫荧光结果提示,突变FANCM蛋白的细胞定位只存在于细胞质,在细胞核中缺失,突变的FANCM定位于染色质的能力受损.结论 FANCM基因c.1152-1155del:p.Leu386Valfs*10纯合突变导致截短的FANCM蛋白产生,并且影响FANCM蛋白在细胞核的定位,抑制其应对DNA损伤修复的能力,从而引起女性不孕.

目的 分析不同地理种群腐食酪螨遗传多样性及遗传分化.方法 2018年6-7月在安徽省芜湖市(WH)、阜阳市(FY)和河北省石家庄市(SJZ)、张家口市(ZJK)4个地区的面粉厂和米厂采集螨虫标本并经形态学和细胞色素C氧化酶亚基1(cox1)分子鉴定筛选出腐食酪螨,PCR扩增腐食酪螨线粒体细胞色素b(Cytb)和核糖体DNA内转录间隔区(ITS)并测序.使用Chromas 2和DNAStar 1.00软件对基因序列进行校对和拼接,使用DnaSP 5.10.00软件计算各种群单倍型多样性(Hd)和核苷酸多态性(Pi),用MEGA 10.2软件包分析种群遗传变异和遗传分化指数(Fst)及基因流(Nm),用Arlequin3.1软件计算Tajima's D值和Fu's FS值并进行中性检验和分子方差分析,使用Network 10.2基于Median-joining法构建单倍型网络关系图,采用最大似然法(ML)对单倍型构建系统进化树.结果 腐食酪螨呈椭圆形,表皮柔软,乳白色或黄棕色,口器高度变异或退化;本研究获得的cox1与GenBank中腐食酪螨cox1(登录号:LC 190838.1)的序列一致性大于98％.腐食酪螨样本Cytb基因长度为372 bp,16个单倍型(H1～H16)中仅H4为共享单倍型(为来自WH和FY种群的9个个体共享),其余为独享单倍型.4个地理种群Hd较高,整体值为0.895(＞0.5),其中以WH种群最高(Hd=0.867),SJZ种群最低(Hd=0.464).基于Cytb序列分析显示腐食酪螨4个地理种群遗传多样性较高(Pi＞0.005);分子方差分析可见腐食酪螨4个地理种群Fst＞0.15(P＜0.05);中性检验结果显示,腐食酪螨Tajima's D值为-0.737 22,Fu's FS值为2.336 33(均P＞0.05).单倍型网络图与系统进化树结果一致,4个地理种群个体相互交织分布,仅ZJK种群个别个体聚为另外一支.ITS序列长度为1 259～1 405 bp,32个单倍型(G1～G2)均为独享单倍型.4个地理种群Hd较高,整体值与分别值为1.000(＞0.5).基于ITS序列分析显示腐食酪螨4个地理种群遗传多样性较高(Pi＞0.005),Fst＞0.25(P＜0.05);Tajima's D 值和 Fu's FS 值分别为 2.030 29 和 3.044 54(均P＞0.05).单倍型网络图与系统进化树结果一致,WH、FY、SJZ种群单倍型聚为一支,ZJK的单倍型单独聚为一支.结论 腐食酪螨4个地理种群遗传多样性较高,地理种群间存在较大遗传分化,FY种群可能有向WH种群扩张的历史,不同腐食酪螨地理种群间发生局部高水平基因交流,未发现明显地理分布格局.

[目的]探究丹参-川芎-红花(丹川红,DCH)及主要吸收成分阿魏酸(FA)对颅脑损伤(TBI)模型大鼠抑郁-心脏损伤的治疗作用及多病发生机制研究.[方法]SD大鼠TBI造模,造模苏醒后给药,24 h后取材.分为空白(Sham)组,模型(Vehicle)组,FA(2 mg/kg)组、DCH(10 g/kg)组.用高尔基染色法检测海马神经元的树突棘密度和树突长度,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测海马、心脏及血清中即刻早期基因(c-Fos)和胃饥饿素(Ghrelin)、心脏内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、血清五羟色胺(5-HT)和炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β);蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马、心脏的脑源性神经营养因子(BDNF),心脏损伤指标肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌凋亡指标半胺氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3).[结果]TBI后大鼠海马神经元树突棘密度和长度均下降,治疗后有所恢复;血清炎性因子应激后明显上升,治疗后下降;5-HT应激后显著下降,治疗后上升.应激后显著下降的心脏eNOS水平治疗后升高,显著上升的心脏损伤指标CK-MB和Caspase3水平治疗后下降.c-Fos、Ghrelin在大鼠血清、海马、心脏中具有一致性的表达特征,前者在应激后表达量增高,给药后下降;后者在应激后表达量下降,给药后上升.BDNF在心脑中表现为应激后下降,给药后上升.[结论]TBI后大鼠具有抑郁-心脏损伤的多病表现,DCH和FA均发挥抗抑郁-心脏保护的作用,可能通过调节Ghrelin-BDNF/c-Fos这一共享途径对TBI后抑郁-心脏损伤共病发挥治疗作用.

目的 制备人Waardenburg综合征点突变SOX10 p.R106W小鼠模型,比较分析该突变在小鼠、小型猪及人中诱发的听觉功能表型的异同.方法 通过比对人、猪和小鼠的SOX10编码蛋白的氨基酸序列,找到与人SOX10 p.R106W突变所对应的小鼠Sox10基因同源位点,通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑引入突变,构建Sox10 c.316A＞T(Sox10 p.R106W)点突变小鼠.采用听觉脑干反应测试、耳蜗组织切片等方法评估突变小鼠听力表型.对耳蜗组织进行mRNA转录组测序,对差异表达基因进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析,借助String数据库分析差异表达基因与Sox10之间的关联性.结果 获得了携带有Sox10 c.316A＞T突变的基因编辑小鼠,该突变小鼠表现为腹部白斑,杂合稳定遗传.与野生型小鼠比较,Sox10 c.316A＞T杂合突变小鼠对声波刺激的敏感性及内耳形态结构均没有明显的差异.转录组分析发现突变小鼠耳蜗中323个基因表达上调,283个基因表达下调,但大部分基因表达差异较小.对差异表达基因GO富集分析发现上调基因与免疫相关,下调基因与神经功能有关.利用String数据库分析显示,表达下调的基因中有5个与Sox10基因有关联,分别是神经丝重多肽(neurofilament heavy polypeptide,Nefh)、脂肪酸 2-羟化酶(fatty acid 2-hydroxylase,Fa2h)、缝隙连接蛋白B1(gap junction protein beta 1,Gjb 1)、神经生长因子受体(nerve growth factor receptor,Ngfr)、锌指蛋白536(zinc finger protein 536,Zfp536),均与内耳发育或功能无关.结论 应用CRISPR/Cas9系统成功构建Sox10 p.R106W基因编辑小鼠,其听力表型无显著改变,与该突变在人和小型猪中诱发的疾病表型差异较大.

目的 观察青娥方含药血清对破骨细胞前体RAW 264.7细胞FA K/Sr c/p130 Cas通路相关基因蛋白表达及上清液炎症因子的影响.方法 制备青娥方含药血清和生理盐水血清,分别干预体外培养的破骨细胞前体RAW 264.7细胞.干预12h和24 h后,提取mRNA和蛋白,荧光定量PCR(qPCR)检测FAK/Src/p130Cas及下游信号关键因子CRK、C3G和RAS mRNA表达的变化,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测FAK/Src/p130Cas及下游信号关键因子CRK、C3G和RAS蛋白表达的变化;应用ELISA法检测细胞上清液IL-6、TNF-α、PGE2含量.结果 与同期生理盐水血清组比较,青娥方含药血清组FAK、Src、p130 Cas、CRK、C3G和RAS的RNA和蛋白表达均明显减少(P ＜0.05,P＜0.01),以FAK、Src、p130Cas下降最为显著,而细胞上清液炎症因子IL-6,TNF-α和PGE2含量明显下降(P＜0.05,P＜0.01).结论 青娥方含药血清能够下调FAK/Src/p130Cas及其下游信号分子的表达,抑制RAW 264.7细胞分泌炎症因子,从而抑制RANKL+ MCSF诱导的破骨细胞分化.