基于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)/磷脂酯肌醇 3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号轴研究赤芍-附子药对对慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)大鼠的治疗作用及对肝细胞再生的影响.采用牛血清白蛋白皮下及尾静脉注射联合脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)腹腔注射构建ACLF大鼠模型,实验设置正常对照(NC)组、模型(vehicle)组、赤芍-附子药对(SFYD,5.85 g·kg-1)组、促肝细胞生长颗粒(HGFG,4.05 g·kg-1)组.苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察大鼠肝组织病理变化.全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(alanineamino transferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transa-minase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL).ELISA 法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎症因子水平.免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞增殖相关抗原(antigen identified by monoclonal antibody,Ki67)及细胞周期蛋白(cell cycle protein B1,CyclinB 1)阳性表达.实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测HGF、结合蛋白Gab1(grb2 associated binding protein 1,Gab1)、PI3K、Akt、磷酸化 PI3K(phosphorylation PI3K,p-PI3K)、磷酸化 Akt(phosphorylation Akt,p-Akt)mRNA 及蛋白表达水平.结果显示,与vehicle组比较,SFYD组大鼠肝组织病理评分降低,肝功能及炎症反应改善,PCNA、Ki67、CyclinB 1荧光表达增强.同时与模型组相比,SFYD组HGF、Gab1蛋白表达上调,PI3K、Akt磷酸化激活.以上研究表明赤芍-附子药对通过减轻肝细胞炎症损伤以及促进肝细胞再生来达到抗肝衰竭的效应,其具体调控机制可能与激活HGF/PI3K/Akt信号通路有关.

目的:探讨肝细胞生长因子（HGF）修饰的人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的作用及其机制。方法:采用实验研究方法。取2021年2—5月于空军军医大学第一附属医院整形科行腹部手术的3名健康女性（10~25岁）废弃脂肪组织，采用胶原酶消化法获取原代ADSC，培养7 d，用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADSC，转染HGF慢病毒，培养5 d，采用成像系统观察细胞荧光情况并计算转染率。取第3~6代ADSC和第3~6代转染HGF的ADSC，均分别采用密度梯度离心法提取其外泌体，即为ADSC外泌体和HGF-ADSC外泌体。采用透射电子显微镜观察外泌体微观形态，采用流式细胞仪检测外泌体的CD9、CD63、CD81阳性表达。取24只6周龄雄性昆明小鼠，制作糖尿病模型后，在其背部制作全层皮肤缺损创面。按照随机数字表法将小鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组和HGF-ADSC外泌体组，每组6只，分别作相应处理。伤后3、7、10、14 d，观察创面愈合情况并计算其愈合率，使用多普勒血流仪检测创基血流强度并计算伤后10 d创基相对血流强度百分比。伤后10 d，采用免疫荧光法检测创面中Ki67阳性细胞数，采用免疫组织化学法检测创面中CD31阳性染色且成管样结构的新生血管数，采用蛋白质印迹法检测创面中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白表达并计算p-PI3K与PI3K比值及p-Akt与Akt比值。伤后14 d，采用苏木精-伊红染色法、Masson染色法分别检测创面皮肤组织缺损长度及胶原新生情况，并计算胶原容积分数（CVF）。样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Tukey检验。结果:原代ADSC培养7 d，细胞呈梭形，生长密集后呈旋涡状排列。培养5 d后，第3代转染HGF的ADSC携带绿色荧光，转染率为85%。ADSC外泌体及HGF-ADSC外泌体微观形态相似，均呈囊泡状结构，平均粒径分别为103、98 nm，均呈CD9、CD63、CD81阳性。伤后3 d，4组小鼠创面的创周均红肿且有少量渗液；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创面逐渐缩小，其余3组创面缩小不明显；伤后10 d，4组创面均缩小、结痂；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面基本愈合，其余3组均有残余创面。伤后3 d，4组创面愈合率接近（ P>0.05）；伤后7、10 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为13.11、13.11、11.89，12.85、11.28、7.74， P<0.01）；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为15.50、11.64、6.36， P值均<0.01）。伤后3 d，4组小鼠创基均无明显血运；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创基开始有微血管形成，其余3组创基仅创缘充血；伤后10 d，除PBS组创基仍无明显血运外，其余3组均有微血管形成；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创基血流信号强于其余3组且分布均匀。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创基相对血流强度百分比明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为23.73、19.32、9.48， P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中Ki67阳性细胞数及新生血管数均明显多于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为19.58、18.20、11.04，20.68、13.79、8.12， P<0.01）。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创面中eNOS蛋白表达水平明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为53.23、42.54、26.54， P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中p-PI3K与PI3K的比值及p-Akt与Akt的比值均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为16.11、11.78、6.08，65.54、31.63、37.86， P<0.01）。伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面皮肤中组织缺损长度明显短于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为20.51、18.50、11.99， P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中CVF明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为31.31、28.52、12.35， P值均<0.01）。 结论:人HGF-ADSC外泌体可增加创基组织新生血管形成，从而显著促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合，其机制可能与HGF-ADSC外泌体通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进创面中eNOS的表达增高有关。

目的:探究miR-93-5p对HepG2细胞增殖、自噬、葡萄糖消耗以及磷脂酰肌醇3-激酶(phos-phatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路的影响.方法:高浓度葡萄糖诱导构建胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)细胞模型,设计合成miR-93-5p inhibitor和NC,结合自噬抑制剂 3-MA,将细胞分为 Control 组、IR 组、IR+inhibitor NC 组、IR+inhibitor 组、IR+3-MA+inhibitor 组.CCK8法检测各组细胞增殖活力,试剂盒检测各组细胞葡萄糖消耗量和细胞糖原合成情况,Western-Blot法检测细胞自噬基因微管相关蛋白 1 轻链 3(autophagy genes microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)蛋白、PI3K/AKT 通路蛋白(AKT、p-AKT)的表达.结果:与对照组相比,IR组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-Ⅱ蛋白表达下降(P＜0.01),LC3-Ⅰ蛋白和p-AKT/AKT值表达均增加(P＜0.01).与IR组和IR+in-hibitor NC组相比,IR+inhibitor组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-Ⅱ蛋白表达增加(P＜0.01),LC3-Ⅰ蛋白和p-AKT/AKT值表达均下降(P＜0.01).与IR+inhibitor组相比,3-MA能逆转miR-93-5p inhibitor的作用.结论:miR-93-5p通过PI3K/AKT通路促进HepG2细胞自噬,进而抑制胰岛素抵抗,缓解糖尿病造成的机体损伤.

目的 探讨龙胆苦苷(GPS)对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾间质纤维化的改善作用及其机制.方法 将25只C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组、模型对照组、GPS低剂量组、GPS高剂量组、厄贝沙坦组,每组各5只.假手术组正常饲养,其余四组采用结扎单侧输尿管的方式建立UUO模型.造模成功后,GPS低、高剂量组分别给予0.1、0.2 g/kg GPS腹腔注射,厄贝沙坦组给予0.02 g/kg厄贝沙坦腹腔注射,模型组和假手术组给予等体积生理盐水腹腔注射,连续7 d.处死小鼠,取肾脏组织,采用HE染色法观察肾组织形态学变化,Masson染色法观察肾组织纤维化情况,采用Western blotting法、RT-qPCR法检测肾组织纤连蛋白(Fn)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白及mRNA表达.另取6只小鼠,随机分为模型组和干预组各3只,建立UUO模型后,干预组给予0.2 g/kg GPS腹腔注射,模型组给予等体积生理盐水腹腔注射,连续7 d.处死小鼠,取肾脏组织进行转录组测序,分析两组差异表达基因,并进行GO和KEGG通路富集,最后采用RT-qPCR法进行验证.结果 与假手术组比较,模型对照组肾小管明显扩张,肾组织大量炎性细胞浸润,肾间质大量胶原纤维沉积;与模型对照组比较,GPS低、高剂量组肾脏组织肾小管扩张、炎性细胞浸润有一定程度减轻,肾间质纤维化改善,其中GPS高剂量组改善效果更明显.与假手术组比较,模型对照组肾脏组织Fn、α-SMA蛋白及mRNA表达水平均升高;与模型对照组比较,GPS低、高剂量组肾脏组织Fn、α-SMA蛋白及mRNA表达水平均降低,且GPS高剂量组低于低剂量组(P均<0.05).测序分析结果显示,模型组与干预组存在710个差异表达基因.GO富集分析显示,差异表达基因主要集中在细胞进程、生物调节、生物进程调控等方面;KEGG通路富集分析发现,差异表达基因涉及Ras、Rap1、PI3K/AKT、MAPK信号通路等.筛选出2个有效基因HGF、CCDC3进行验证,干预组肾组织HGF、CCDC3表达水平较模型组升高(P均<0.05),与测序结果一致.结论 GPS能够有效改善UUO小鼠肾脏纤维化,且高剂量GPS改善作用更明显;其作用机制可能与上调HGF及CCDC3表达作用于Rap1、Ras、PI3K/AKT、MAPK信号通路等生物学途径有关.

目的 基于动物实验研究黄芪建中汤对脾胃虚寒证胃溃疡的治疗作用及抗黏膜损伤机制.方法 将大鼠随机分为正常组、模型组、西药组及中药组,每组 15 只.除正常组外,另 3组均应用耗气破气法+饥饱失常法+冰醋酸法复制脾胃虚寒证胃溃疡模型.中药组、西药组各予黄芪建中汤(6.8 g/kg)、奥美拉唑(4.2 mg/kg)灌胃,另两组则灌以等体积蒸馏水.给药 20d后计算胃溃疡指数;HE染色观察胃组织形态;ELISA法检测血清白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;RT-PCR检测胃组织肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymal epithelial transition factor,c-Met)、磷脂酰肌醇 3-激酶(hosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)mRNA表达水平;West-ern blot法检测PI3K、磷酸化AKT(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、EGFR蛋白表达;免疫组织化学检测胃组织HGF、c-Met的表达水平.结果 与正常组比较,模型组胃溃疡指数增高(P＜0.05),胃组织溃疡损伤明显,血清IL-18、IL-1β、TNF-α水平增高(均P＜0.05),胃p-AKT、AKT、EGFR蛋白及mRNA表达下降(均P＜0.05);与模型组比较,中药组胃溃疡指数、炎症因子水平(均P＜0.05)显著降低,胃黏膜受损程度改善(P＜0.05),胃HGF、c-Met、PI3K、p-AKT、EGFR蛋白及mRNA表达水平上调(均P＜0.05).结论 黄芪建中汤对胃溃疡有良好的治疗作用,其机制可能与激活HGF/c-Met、PI3K/AKT通路以增强胃黏膜的防御机制和减轻炎症反应有关.

目的 通过检测肝细胞生长因子(HGF)及其受体(c-Met)在早期小鼠卵巢组织的表达情况,探讨HGF/c-Met信号通路在小鼠早期卵泡发育的相关性,并通过生物信息学分析HGF/c-Met通路的生物学过程及涉及的细胞内信号通路,为后续研究HGF/c-Met通路调节早期卵泡发育的分子机制打下基础.方法 选用昆明小鼠以雌∶雄(2∶1)合笼,收集生后3、7、14、21 d卵巢,采用免疫组学、蛋白免疫印迹分别检测卵巢HGF和c-Met蛋白表达及表达水平;实时荧光定量PCR检测卵巢HGF、c-Met 的mRNA表达水平.结果 HGF及c-Met蛋白在3、7、14、21 d卵巢中均有表达,且表达量随着小鼠日龄增长而增加(P<0.05),HGF、c-Met的mRNA水平也呈现相同的趋势(P<0.05);生物信息学分析发现HGF/c-Met通路涉及了多种生物学过程及PI3K/AKT等信号通路.结论 HGF/c-Met通路参与小鼠早期卵泡发育,并可能通过细胞内信号通路PI3K/AKT调控原始卵泡启动及卵泡发育的过程.

Hereditary gingival fibromatosis(HGF)is a rare inherited condition with fibromatoid hyperplasia of the gingival tissue that exhibits great genetic heterogeneity.Five distinct loci related to non-syndromic HGF have been identified;however,only two disease-causing genes,SOS1 and REST,inducing HGF have been identified at two loci,GINGF1 and GINGF5,respectively.Here,based on a family pedigree with 26 members,including nine patients with HGF,we identified double heterozygous pathogenic mutations in the ZNF513(c.C748T,p.R250W)and KIF3C(c.G1229A,p.R410H)genes within the GINGF3 locus related to HGF.Functional studies demonstrated that the ZNF513 p.R250W and KIF3C p.R410H variants significantly increased the expression of ZNF513 and KIF3C in vitro and in vivo.ZNF513,a transcription factor,binds to KIF3C exon 1 and participates in the positive regulation of KIF3C expression in gingival fibroblasts.Furthermore,a knock-in mouse model confirmed that heterozygous or homozygous mutations within Zfp513(p.R250W)or Kif3c(p.R412H)alone do not led to clear phenotypes with gingival fibromatosis,whereas the double mutations led to gingival hyperplasia phenotypes.In addition,we found that ZNF513 binds to the SOS1 promoter and plays an important positive role in regulating the expression of SOS1.Moreover,the KIF3C p.R410H mutation could activate the PI3K and KCNQ1 potassium channels.ZNF513 combined with KIF3C regulates gingival fibroblast proliferation,migration,and fibrosis response via the PI3K/AKT/mTOR and Ras/Raf/MEK/ERK pathways.In summary,these results demonstrate ZNF513+KIF3C as an important genetic combination in HGF manifestation and suggest that ZNF513 mutation may be a major risk factor for HGF.

目的 分析玻璃酸钠影响肝细胞生长因子(HGF)受体(c-Met)介导的人胃癌(GC)AGS细胞增殖及其作用机制.方法 应用不同浓度的玻璃酸钠作用于AGS细胞.应用HGF激活c-Met.细胞增殖与毒性检测试剂盒(CVTK)测定细胞增殖;Western印迹测定c-Met酪氨酸(Tyr)1234 位点磷酸化(p-c-Met-Y1234)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-MEK)、磷酸化细胞外调节激酶(p-ERK)1/2、磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)相对蛋白表达.结果 HGF明显促进AGS细胞增殖,并诱导细胞内p-c-Met(Y1234)、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT明显高表达(P＜0.05);不同浓度玻璃酸钠作用细胞后,由HGF引起的细胞增殖明显受到抑制,p-c-Met(Y1234)、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT表达水平显著降低(P＜0.05).结论 璃酸钠通过抑制人AGS细胞的c-Met酪氨酸磷酸化,调控HGF/c-Met介导的MEK/ERK 和PI3K/AKT信号通路,进而抑制人AGS细胞的增殖.

目的 研究富血小板血浆(PRP)在不同制备条件下生长因子表达谱的变化,为临床治疗选择不同类型PRP提供实验依据.方法 使用血液成分分离机单采7份PRP(30 mL/份),同一份PRP各留取10 mL并随机分成贫血小板血浆(PPP)对照组、PRP凝胶上清组和PRP裂解液组,PRP凝胶上清组采用牛凝血酶和葡萄糖酸钙制成预混剂,预混剂与PRP按照1:9的比例添加以获取PRP上清液;PRP裂解液组采用在-20℃和37℃反复冻存融化5次,获取血小板裂解液.应用Quantibody?生长因子蛋白芯片检测获取的样品中生长因子谱的变化,并采用ELISA对差异生长因子进行验证.结果 与PPP对照组比较,在PRP凝胶上清组中共有5个生长因子表达升高,分别为脑源性神经营养因子(BDNF,14.64倍),血小板衍生生长因子(PDGF-AA,4.53倍),表皮细胞生长因子(EGF,4.52倍),血管内皮生长因子(VEGF,3.45倍)和肝细胞生长因子(HGF,2.16倍),GO和KEGG分析表明这些因子主要富集于细胞迁移和Ras及PI3K-Akt信号通路激活,参与组织修复;而在PRP裂解液组中升高的生长因子分别为BDNF(20.74倍),EGF(11.12倍),转化生长因子-β1(TGF-β1,5.76倍),减少的生长因子是胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP-6,1.46倍),这些因子主要富集于MAPK信号通路和FoxO信号通路发挥抗炎作用.结论 PRP凝胶上清和PRP裂解液均可释放多种生长因子;PRP凝胶上清产生的生长因子主要参与创面修复和伤口愈合,而PRP裂解液产生的生长因子主要参与组织修复和抗炎,因此针对不同的临床治疗目的,应选择不同方式制备的PRP制品,以达到最佳的治疗效果.

目的 探讨芍药苷对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移侵袭和血管生成的影响,以及与c-Met受体和下游分子的关系.方法 用含10％胎牛血清的内皮细胞培养基(ECM)体外培养HUVEC细胞,并且加入20 ng/ml肝细胞生长因子(HGF).用0、5、10、15、20 mmol/L芍药苷分别处理细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测芍药苷对细胞的毒性作用.Lipofectamine(R)3000转染c-Met质粒,Transwell法观察细胞的迁移侵袭能力,血管生成实验检测细胞血管生成的作用,Western blot检测相关蛋白表达量的变化.结果 当芍药苷浓度为15mmol/L时抑制HUVEC细胞的增殖(76.667±7.506,P=0.000).5、10mmol/L芍药苷可以抑制HUVEC细胞的迁移侵袭(249.333±42.360,P5 =0.001;97.667±21.032,P10=0.000)和血管生成(12.667±1.528,P5 =0.001;6.333±1.528,P10=0.000),抑制c-Met(0.833±0.702,P=0.000)及其下游分子磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(0.420±0.030,P=0.000;0.370±0.050,P=0.000;0.730±0.121,P=0.001)和P70S6K的磷酸化(0.420±0.061,P=0.000),并降低VEGF的表达(0.317±0.031,P=0.000).转染c-Met质粒后,HUVEC细胞c-Met表达量明显升高(0.793±0.045,P=0.001),并且芍药苷抑制HUVEC细胞的侵袭迁移(269.000±18.520,P=0.000)、血管生成(20.667±1.528,P=0.000),抑制c-Met(0.387±0.067,P=0.003)及下游通路的作用被逆转(PI3K:0.677±0.046,P=0.000;Akt:0.577±0.055,P=0.000;mTOR:0.543±0.078,P=0.001;P70S6K:0.433±0.090,P=0.000),降低VEGF的表达(0.763±0.042,P=0.001).结论 芍药苷通过c-Met/PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制HUVEC细胞的迁移侵袭,并调节VEGF的表达,从而使HUVEC细胞的血管生成减少.