目的:探讨Beclin1对肺癌细胞紫杉醇耐药的影响及其分子机制。方法:人非小细胞肺癌A549和小鼠LLC Lewis肺癌细胞采用梯度递增法建立紫杉醇耐药细胞株A549/DOX和LLC/DOX。采用蛋白质免疫印迹(Western blot)分析耐药和非耐药细胞株Beclin1蛋白表达水平。采用对照慢病毒和Beclin1慢病毒感染A549/DOX和LLC/DOX，建立A549/DOX组、A549/DOX/Beclin1组、LLC/DOX和LLC/DOX Beclin1组，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、克隆形成实验和体外移植瘤分析紫杉醇对4组细胞增殖的影响。采用流式细胞仪分析紫杉醇对4组细胞凋亡的影响；Western blot分析4组细胞凋亡和自噬相关蛋白表达水平。计量资料比较采用 t检验。 结果:A549/DOX组和LLC/DOX组细胞48 h吸光度( A)值(1.63±0.05、1.72±0.13)明显高于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin1组(1.09±0.13、1.21±0.06)，差异有统计学意义( t＝9.895、9.624， P<0.05)。EdU染色结果显示，A549/DOX组和LLC/DOX组细胞EdU染色阳性率[(93.71±2.81)%、(95.29±3.54)%]明显高于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin1组[(62.14±7.52)%、(70.14±6.09)%]，差异有统计学意义( t＝10.410、9.435， P<0.05)。克隆形成实验结果显示，A549/DOX组和LLC/DOX组细胞克隆形成数量[(115.43±10.75)、(142.57±23.71)个]明显高于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin1组[(71.57±7.98)、(86.14±3.13)个]，差异有统计学意义( t＝8.667、6.224， P<0.05)。A549/DOX组和LLC/DOX组细胞肿瘤体积[(823.71±44.89)、(1 144.86±106.45) mm 3]明显高于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin1组[(585.57±41.80)、(774.14±48.95) mm 3]，差异有统计学意义( t＝8.667、6.224， P<0.05)。A549/DOX组和LLC/DOX组肿瘤重量[(2.53±0.27)、(2.87±0.41) g]明显高于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin1组[(1.15±0.09) g、(1.46±0.13) g]，差异有统计学意义( t＝12.660、8.730， P<0.05)。A549/DOX组和LLC/DOX组细胞凋亡水平[(33.16±3.31)%、(29.32±3.62)%]明显低于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin组细胞[(56.00±3.87)%、(62.05±4.15)%]，差异有统计学意义( t＝12.660、8.730， P<0.05)。A549/DOX和LLC/DOX细胞p62蛋白表达水平(2.82±0.19、2.59±0.33)明显高于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin1组p62蛋白表达水平(1.01±0.10、1.21±0.10)，差异有统计学意义( t＝22.400、10.500， P<0.05)。A549/DOX组和LLC/DOX组细胞半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达水平(0.65±0.12、0.78±0.06)明显低于A549/DOX/Beclin1组和LLC/DOX Beclin1组(1.49±0.14、1.56±0.12)，差异有统计学意义( t＝11.470、15.280， P<0.05)。 结论:Beclin1通过调节细胞凋亡和自噬，介导肺癌细胞对紫杉醇的耐药性。

目的:观察内皮素受体A(ETA)抑制剂BQ-123对C57BL/6小鼠骨癌痛的镇痛效果，并探讨脊髓星形胶质细胞活化及大电导钙激活钾离子通道(BK Ca)通道的作用。 方法:选用C56BL/6雄性小鼠30只，体重18~20 g，随机数字表法分为3组( n＝10)，假手术组(S组)、癌痛组(BCP组)、BQ-123组(BQ组)。BCP组和BQ组于左下肢股骨骨髓腔内接种Lewis肺癌细胞(2×10 6个)制备骨癌痛模型。S组则注射等量D-Hanks’液。于接种后第7~21天，BQ组腹腔内注射BQ-123(10 nmol/d)，BCP组则注射等量双蒸水(10 μl/d)。于术前1 d(T0)、术后第7天(T1)、第10天(T2)、第13天(T3)、第15天(T4)、第18天(T5)、第21天(T6)测定机械痛阈值(MWT)和后足使用评分。术后第21天，取L4~L6脊髓，分别采用蛋白质印迹法(Western blot)法检测BK Ca通道蛋白、星形胶质细胞活化标志物胶质纤维状酸性蛋白(GFAP)蛋白表达，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-1β的表达。正态分布资料组间比较采用单因素方差分析或重复测量资料方法分析，两两比较采用Tukey检验。 结果:BQ组于T2~T6时时间点MWT高于BCP组[(3.97±0.37) g比(3.31±0.56) g、(3.89±0.45) g比(3.22±0.88) g、(3.48±0.56) g比(2.78±0.51) g、(3.13±0.49) g比(2.20±0.33) g、(3.28±0.52) g比(1.95±0.54) g]，差异有统计学意义( q＝3.367、3.418、3.571、4.744、6.734， P<0.05)；于T3~T6时行走评分高于BCP组[(2.70±0.72) g比(2.20±0.49) g、(2.63±0.59) g比(1.77±0.40) g、(2.02±0.65) g比(1.30±0.51) g、(1.83±0.61) g比(1.27±0.52) g]，差异有统计学意义( q＝3.406、5.859、4.905、3.815， P<0.05)；脊髓BKCa通道表达明显高于BCP组(0.27±0.03比0.18±0.02)，GFAP表达低于BCP组(0.31±0.02比0.41±0.03)，差异有统计学意义( q＝3.406、7.276， P<0.05)；TNF-α和IL-1β表达低于BCP组[(286.45±15.94) pg/mg蛋白比(217.62±15.48) pg/mg蛋白、(178.28±18.26) pg/mg蛋白比(148.15±12.87) pg/mg蛋白]，差异有统计学意义( q＝8.152、4.795， P<0.05)。 结论:腹腔内注射ETA拮抗剂BQ-123可减轻小鼠骨癌痛，其机制可能与BK Ca通道表达上调、脊髓星形胶质细胞活化受抑制有关。

目的:探讨谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)对小鼠路易斯肺癌细胞放射敏感性的调控作用。方法:使用shRNA干扰表达慢病毒和阴性对照病毒分别感染路易斯肺癌(LLC)细胞，并筛选出稳转株；应用RT-PCR和蛋白免疫印迹(WB)法检测LLC细胞GSTP1 mRNA和蛋白质表达水平，验证敲低效果；使用细胞增殖检测(CCK-8)法检测照射后细胞活力；使用克隆形成实验检测照射后细胞克隆形成能力；使用流式细胞术检测照射后细胞的凋亡水平。构建荷瘤小鼠并进行照射，检测照射后肿瘤体积变化；TUNEL染色检测照射后肿瘤细胞凋亡水平；免疫荧光检测照射后肿瘤内CD 4+CD 8+T细胞数量。 结果:RT-PCR和WB结果显示shRNA慢病毒干扰后，GSTP1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。下调GSTP1能降低照射后细胞活力及克隆形成能力，并提高照射后细胞凋亡率。GSTP1敲低组荷瘤小鼠照射后肿瘤体积明显小于对照组，而肿瘤凋亡水平高于对照组，肿瘤内浸润CD 4+CD 8+T细胞数量亦高于对照组。 结论:下调GSTP1能够显著增加LLC细胞的放射敏感性，并增加肿瘤组织中淋巴细胞的浸润。

目的 基于AMPK/ULK1信号通路观察归芪益元膏联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及作用机制.方法 小鼠右侧腋下接种Lewis肺癌细胞建立皮下肿瘤模型.将小鼠随机分为空白组、模型组、顺铂组和中药高、中、低剂量+顺铂组,每组10只,顺铂组腹腔注射顺铂5 mg/kg(每7 d一次),中药高、中、低剂量+顺铂组在顺铂组基础上分别予归芪益元膏7.0、3.5、1.75 g/kg灌胃,每日1次,连续14 d.HE染色观察小鼠肿瘤组织形态,免疫组化测定肿瘤组织p-AMPK、p-ULK1蛋白表达,透射电镜观测肿瘤组织自噬小体数量,RT-PCR测定小鼠肿瘤组织p62、Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达,Western blot检测肿瘤组织Beclin-1、p62、Atg5、LC3和AMPK/ULK1信号通路蛋白表达.结果 与模型组比较,各给药组小鼠瘤质量明显降低(P<0.05);肿瘤组织出现片状坏死区域且自噬小体数量增加,Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达升高,Beclin-1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1蛋白表达升高,p62 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05).与顺铂组比较,中药高、中剂量+顺铂组小鼠瘤质量降低(P<0.05),抑瘤率增加;中药高、中、低剂量+顺铂组小鼠肿瘤组织ULK1蛋白和Atg5 mRNA表达明显升高(P<0.05);中药高、中剂量+顺铂组Beclin-1、LC3 mRNA表达明显升高(P<0.05),Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、p-ULK1蛋白表达明显升高(P<0.05),p62蛋白表达明显降低(P<0.05);中药高剂量+顺铂组p62 mRNA表达明显降低(P<0.05),Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.05).结论 归芪益元膏联合顺铂可能通过激活AMPK/ULK1信号通路促进肿瘤细胞自噬,进而抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠皮下肿瘤生长.

目的:探讨长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)1010001N08Rik和GATA6在高氧暴露小鼠肺癌细胞(Lewis lung carcinoma cell,LLC细胞)中表达量的变化与相关性,及其介导Wnt/β-catenin信号通路参与高氧肺损伤的机制.方法:(1)将LLC细胞分为空气组、高氧暴露24 h组和高氧暴露48h组,应用RT-PCR和Western blot法分别检测lncRNA1010001N08Rik、GATA6、Wnt及β-catenin的mRNA及相关蛋白表达水平.(2)将LLC细胞分为无干扰空气组、无干扰高氧组、NC-siRNA干扰高氧组、siRNA 干扰高氧组.应用 RT-PCR 和 Western blot 法分别检测 lncRNA1010001N08Rik、GATA6、Wnt 及 β-catenin 的 mRNA及相关蛋白表达水平,流式细胞术检测各组细胞凋亡.(3)利用GraphPadPrism 9.4.1进行数据可视化.(4)采用SPSS 26.0统计软件进行数据处理,两组间数据比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析.(5)将Wnt、Fzd2、GATA6等相关基因输入string11.0数据库构建PPI网络并导出PPI网络图.结果:(1)与空气组相比较,高氧暴露24h组和48h组GATA6的mRNA表达量下降,lncRNA1010001N08Rik、Wnt、β-catenin的mRNA表达量增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).(2)与空气组相比,高氧暴露24h组和48h组GATA6蛋白表达量下降,Wnt、β-catenin蛋白表达量增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).(3)与无干扰空气组相比,无干扰高氧组、NC-siRNA干扰高氧组的GATA6的mRNA表达量和蛋白表达量下降,1010001N08Rik的mRNA表达量、Wnt、β-catenin的mRNA表达量和蛋白表达量增加;无干扰高氧组与NC-siRNA干扰高氧组的比较差异无统计学意义;与干扰高氧组与NC-siRNA干扰高氧组相比,siRNA干扰高氧组GATA6的mRNA表达量和蛋白表达量增加,1010001N08Rik的mRNA表达量、Wnt、β-catenin的mRNA表达量和蛋白表达量下降,差异均具有统计学意义(P＜0.05).(4)与无干扰空气组相比,无干扰高氧组、NC-siRNA干扰高氧组细胞凋亡率增加;无干扰高氧组与NC-siRNA干扰高氧组的比较差异无统计学意义;与无干扰高氧组与NC-siRNA干扰高氧组相比,siRNA干扰高氧组的细胞凋亡率下降,差异均具有统计学意义(P＜0.05).(5)根据string11.0数据库导出Wnt、Fzd2、GATA6等相关基因的PPI网络图显示,GATA6与Wnt有密切相关.结论:高氧暴露下,LCC细胞中lncRNA1010001N08Rik可能通过下调GATA6的表达激活Wnt/β-catenin信号通路的传导,从而促进高氧肺损伤的形成过程.

目的 基于lncRNA H19/miR-19b3p/FTH1轴探讨归芪益元膏联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及机制.方法 60只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机取10只作为空白组,其余50只皮下接种Lewis肺癌细胞复制肺癌小鼠模型.将成模小鼠随机分为模型组、顺铂组和中药低、中、高剂量联合顺铂组,每组10只,顺铂组予顺铂5 mg/kg腹腔注射,中药低、中、高剂量联合顺铂组予归芪益元膏1.75、3.5、7.0 g/kg灌胃联合顺铂5 mg/kg腹腔注射,空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃,连续14 d.观察小鼠一般状况,测量小鼠瘤质量并计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数,HE染色观察肿瘤组织病理形态,检测肿瘤组织丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢(H2O2)、亚铁离子(Fe2+)含量,免疫组化和Western blot检测肿瘤组织核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白重链1(FTH1)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测肿瘤组织lncRNA H19、miR-19b3p mRNA表达.结果 与空白组比较,模型组小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数均降低(P<0.05).与模型组比较,各给药组小鼠一般状况不同程度改善,瘤质量减少(P<0.05),脾脏指数及胸腺指数升高(P<0.05),肿瘤细胞溶解、破裂、数量减少,肿瘤组织MDA、H2O2、Fe2+含量升高(P<0.05),GSH含量降低(P<0.05),Nrf2、GPX4、FTH1、SLC7A11蛋白表达降低(P<0.05),lncRNA H19 mRNA表达降低(P<0.05),miR-19b3p mRNA表达升高(P<0.05);与顺铂组比较,中药高剂量联合顺铂组小鼠瘤质量减少(P<0.05),体质量、脾脏指数和胸腺指数升高(P<0.05),肿瘤组织MDA、H2O2、Fe2+含量升高(P<0.05),GSH含量降低(P<0.05),Nrf2、FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05),lncRNA H19 mRNA表达降低(P<0.05),miR-19b3p mRNA表达升高(P<0.05).结论 归芪益元膏联合顺铂对Lewis肺癌小鼠具有明显抑瘤作用,其作用机制可能与调节lncRNA H19/miR-19b3p/FTH1轴相关铁死亡分子表达有关.

目的 探讨玉屏风散对程序性死亡受体1(PD-1)-程序性死亡配体-1(PD-L1)结合及对肺癌细胞在体内外生长的影响.方法 MTT法检测玉屏风散提取物对小鼠Lewis肺癌LLC细胞生长的影响;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测玉屏风散提取物对T细胞和LCC细胞共培养中靶细胞杀伤性作用;酶联免疫吸附(ELISA)实验检测玉屏风散提取物对PD-1和PD-L1结合的阻断作用,以及对γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放水平的影响;同基因肿瘤模型分析玉屏风散对肺癌LLC细胞体内生长的抑制作用;免疫组化染色考察玉屏风散对肿瘤组织内CD4+T细胞、CD8+T细胞浸润的影响.结果 玉屏风散呈剂量依赖性抑制LLC细胞的生长及内源性PD-L1蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01),竞争性阻断 PD-1 和 PD-L1 结合(P＜0.05,P＜0.01),促进 T 细胞 IFN-γ和 TNF-α 的释放(P＜0.05,P＜0.01),阻断PD-L1对T细胞功能性抑制作用(P＜0.05,P＜0.01).玉屏风散可以抑制LLC肿瘤生长(P＜0.01),增加CD4+T、CD8+T细胞的浸润数量(P＜0.01).结论 玉屏风散在体外细胞模型中可阻断PD-L1对T细胞功能的抑制作用,在同源小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤效果,可增强CD4+T细胞、CD8+T细胞对癌细胞的杀伤作用.

目的:基于"正虚伏毒"理论,探讨金复康中有效的"扶正"和"蠲毒"组分黄芪甲苷Ⅳ联合重楼皂苷Ⅶ抑制Lewis肺癌细胞转移的免疫学机制.方法:C57BL/6J小鼠尾静脉注射Lewis细胞建立肺癌转移动物模型,将小鼠按随机表法随机分为治疗组和对照组(每组8只),治疗组采用金复康有效组分黄芪甲苷Ⅳ(25 mg/kg)联合重楼皂苷Ⅶ(2.5 mg/kg)进行干预,4周后观察小鼠肺和肝转移情况,H-E染色观察肺和肝转移灶病理组织变化,流式细胞术检测外周血和脾组织中NK细胞的比例,ELISA法检测血清中TNF-α、IFN-γ水平,免疫组化法检测转移灶组织中Ki-67蛋白的表达水平,免疫荧光法检测转移灶组织中NK细胞的浸润和IFN-γ分泌水平.免疫磁珠法分选健康小鼠脾内的NK细胞,然后与黄芪甲苷Ⅳ(5 μmol/L)、重楼皂苷Ⅶ(0.5 μmol/L)及两药联合干预后的Lewis细胞共培养,流式细胞术检测共培养后NK细胞的脱颗粒水平,LDH法检测NK细胞对Lewis细胞的杀伤活性.结果:与对照组相比,经黄芪甲苷Ⅳ联合重楼皂苷Ⅶ干预后的小鼠肺转移和肝转移灶的数目明显减少(均P<0.05),且转移负荷也显著降低(均P<0.05);转移灶中Ki-67蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),转移灶组织中NK细胞的浸润水平显著增加,且IFN-γ从NK细胞的胞内释放至胞外.此外,模型小鼠脾组织中的NK细胞比例显著降低(P<0.05)而外周血中的NK细胞水平却显著升高(P<0.05),小鼠血清中IFN-γ的水平显著减少而TNF-α的水平却显著升高(均P<0.05).体外研究发现,黄芪甲苷Ⅳ和重楼皂苷Ⅶ单药或联合干预后,NK细胞的脱颗粒水平显著增加(P<0.05),但并未提高NK细胞对Lewis细胞的杀伤活性(P>0.05).结论:金复康中的有效组分黄芪甲苷Ⅳ联合重楼皂苷Ⅶ可通过促进NK细胞浸润到肿瘤组织内和增强IFN-γ分泌以抑制Lewis肺癌细胞的肺转移和肝转移,研究结果为"正虚伏毒"理论提供了科学依据.

目的:探讨不同剂量复方蟾酥胶囊对C57BL/6J小鼠Lewis肺癌的抑制作用.方法:选取60只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为空白组10只和造模组50只.空白组单独饲养,造模组采用小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)进行肺癌肿瘤右侧腋窝皮下造模,造模成功后随机分为模型组、顺铂组和复方蟾酥胶囊低、中、高剂量组,每组各10只.顺铂组隔日腹腔注射顺铂,复方蟾酥胶囊低、中、高剂量组每天用不同剂量复方蟾酥胶囊溶液[0.1365、0.273、0.546 g/(kg·d)]灌胃,空白组不予处理;模型组灌胃生理盐水,14 d后处死小鼠并取出肿瘤组织及肺组织.采用ELISA法、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法、HE染色检测小鼠肿瘤组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达、蛋白表达及肺组织病理情况来测定肿瘤抑制情况.结果:与模型组比较,复方蟾酥胶囊中剂量组及顺铂组瘤重显著降低(P<0.05),TNF-α水平降低(P<0.05,P<0.01),显著上调Caspase-3 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01,P<0.0001),显著下调VEGF mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01,P<0.001);模型组肺组织中多见肺泡壁增厚,伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润,局部支气管可见上皮细胞坏死,核碎裂,有明显肺水肿及出血,顺铂组和复方蟾酥胶囊各剂量组能明显改善上述情况,且肺泡腔内有嗜酸性浆液样物质渗出.结论:复方蟾酥胶囊具有抑制Lewis肺癌瘤体生长的作用.

目的 研究红景天苷(Sal)对小鼠Lewis肺癌转移瘤恶性胸腔积液(MPE)的抑制作用.方法 采用Lewis肺癌细胞胸腔注射建立C57BL/6小鼠MPE模型;建模后随机分为正常组、模型组、Sal组、顺铂组(DDP组)、红景天苷+顺铂组(Sal+DDP组);实验结束后,收集各组小鼠胸水并测量胸水体积、胸壁转移瘤个数以及转移瘤质量,记录各组小鼠生存周期.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠血清中TNF-α、HIF-1α;采用Real-timeRT-PCR、Western blot检测小鼠胸水VEGF及VEGFmRNA水平.结果 MPE小鼠经治疗后,与模型组比较,Sal+DDP联合组小鼠生存周期显著延长(P=0.0021);Sal组、DDP组和联合组小鼠MPE体积,胸壁转移瘤数目,转移瘤质量均显著减轻(P＜0.01);Sal组、DDP组和联合组外周血中TNF-α水平显著升高,HIF-1α水平显著降低(P＜0.05);实验组各组胸腔积液中VEGF、VEGFmRNA水平均降低(P＜0.05),其中DDP组和联合组差异显著(P＜0.01).结论 Sal联合顺铂胸腔灌注治疗MPE效果显著,可能与HIF-1α-VEGF分子通路抑制以及TNF-α的激活有关.